Chelex-100法提取DNA用于差異甲基化基因座檢測的研究

成 振 嚴 鵬 白麗娟 賈琳娜 郭大瑋

山西醫科大學法醫學院，太原 030001

越來越多的研究資料表明，來自雙親的同源染色體或者等位基因有功能上的差異：有些只有父源的基因有轉錄活性，而母源的等位基因則一直處于沉默狀態，另一些基因的情況則相反。這是由于來源于某一親本的等位基因或其所在的染色體發生了表觀遺傳修飾，導致不同親本來源的兩個等位基因在子代細胞中表達不同。這種親緣依賴的差異表達現象被稱為基因組印記，受印記機制調控而差異表達的基因稱之為印記基因[1]，許多與印記基因和印記控制中心鄰近的序列存在DNA甲基化修飾及差異甲基化序列[2]，目前對于甲基化的研究多采用甲基化敏感性酶限制性內切酶-PCR法[3]。它是利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區不切割而對未甲基化區切割的特性，將DNA消化為大小不同的片段后再進行分析的一種研究甲基化的方法[4-5]。目前用甲基化敏感性限制性內切酶酶切的DNA大多是用有機溶劑法（酚/氯仿）提取或純化的DNA，而未見Chelex-100法提取DNA作為酶切底物應用于差異甲基化基因座檢測的報道。本研究對Chelex-100法提取的DNA應用于差異甲基化的檢測進行了分析。

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

100份無關人血由山西醫科大學法醫鑒定中心提供；HhaⅠ購自NEB公司；試驗中引物由英濰捷基（上海）貿易公司合成，OPC純度。Taq酶和Ex Taq Hot Start Version購自寶生物工程有限公司。

1.2 基因組DNA的提取

Chelex-100法提取人血DNA：①向1.5 ml EP管中加入1 ml去離子水，取20μl的枸櫞酸鈉抗凝樣本至1.5 ml EP管中，充分振蕩混勻，室溫靜置20 min，以裂解紅細胞，13 000 r/min離心5 min，棄去液體；②加入1 ml滅菌去離子水，振蕩混勻按上述步驟反復用滅菌去離子水洗滌，直至上清液無色；③加入20 mg/ml蛋白酶 K 2 μl，56℃水浴 60~90 min，100℃沸水煮15 min，使蛋白充分變性，Chelex-100滅活；④13000r/min離心5 min，吸取上清液至另一EP管中備用。

酚/氯仿法提取人血DNA：①400μl抗凝血中加加入1 ml滅菌去離子水，振蕩混勻，13 000 r/min離心5 min，棄去上清液，細胞沉淀中再用1 ml去離子水懸浮，混勻后離心，重復數次至上清液變為無色為止；②上述處理后的樣品加TKM2500μl，20 mg/ml PK 3μl混勻后于56℃水浴3～5 h，至液體完全透明；③一次等體積苯酚，一次苯酚/氯仿，一次氯仿抽提，每次抽提需要小心水相和油相充分混勻，13 000 r/min離心5 min，盡量將水相轉移至另一離心管中；④向上清液中加2.5倍體積的冰無水乙醇，同時加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，混勻后在-20℃沉淀1 h，14 000 r/min離心20 min，棄去上清液，加入 3倍體積75%空氣干燥，采用適量的去離子水溶解，-20℃保存備用。

1.3 定量模板量

經典酚/氯仿法提取DNA的定量：紫外分光光度計測定OD260并定量；Chelex-100法提取DNA的定量：qPCR絕對定量。

1.4 篩選雜合子

對Chelex-100法提取的基因組DNA以CD作為引物進行 PCR 擴增，50 μl體系：10×PCR Buffer 5 μl，dNTP混合物4μl，10μmol/L引物1μl，Taq聚合酶1.25U，模板約40 ng，去離子水補至50μl。擴增條件：94℃預變性 3 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環；72℃延伸3 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，純合子為一條帶，雜合子為兩條帶。

1.5 對雜合子樣本基因組DNA用甲基化敏感酶HhaⅠ消化

酶切體系20μl：雜合子樣本基因組DNA約20 ng，HhaⅠ 30 U，10×Buffer4 2 μl，BSA 0.2 μl，去離子水補齊至 20 μl，37℃ 15 h，65℃ 20 min 停止酶切離心后備用。

1.6 對甲基化敏感酶HhaⅠ處理過的雜合子基因組DNA用AB引物進行PCR擴增

50 μl體系：2GC×PCR Buffer 25 μl，dNTP 混合物4 μl，10 μmol/L AB 引物 1 μl，Ex Taq Hot Start Version 1.25 U，模板4μl，去離子水補至50μl。擴增條件：95℃預變性 3 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min，20個循環；72℃延伸5 min。

1.7 以AB引物的擴增產物為模板用CD引物進行PCR擴增

50μl體系：10×PCRBuffer 5 μl，dNTP 混合物 4 μl，10 μmol/L CD 引物 1 μl，Taq酶 1.25 U，模板 4 μl，去離子水補至50μl。擴增條件：95℃預變性3 min；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，20 個循環；72℃延伸 3 min，將CD引物擴增后產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離，254 nm紫外燈下觀察結果。

2 結果

6泳道只擴增出父源一方的等位基因，表明此位點確為差異甲基化位點。1、3泳道也只擴增出父源一方等位基因，表明HhaⅠ在Chelex-100法提取的DNA中也能夠工作，Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物用于差異甲基化基因座的檢測（圖1）。

圖1 以AB引物的擴增產物為模板用CD引物進行PCR擴增結果圖圖上方為陰極，下方為陽極，1、3泳道為不同樣本Chelex-100法提取的DNA加酶實驗組；2、4泳道為1、3泳道未加酶 （由等量去離子水代替）的陰性對照組；6泳道為酚/氯仿法提取DNA加酶陽性對照組；7泳道為6泳道未加酶（由等量去離子水代替）的陰性對照組；泳道5為 Maker，大小 500 bp

3 討論

Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物應用于差異甲基化基因座的檢測，筆者認為有以下兩方面的原因：①法醫實際工作中用Chelex-100提取法提取的DNA一般用于進行PCR，PCR反應體系中DNA聚合酶一般除具有耐高溫的特性外，其他性質與一般的生物酶相類似。②影響限制性內切酶酶切反應效率的因素包括DNA純度、反應緩沖液、溫度、pH值等。其中提取的DNA中包含有蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、金屬離子等雜質，會影響限制性內切酶的活性，從而影響酶切反應的效率，而Chelex-100提取法提取的DNA中一般不會存在酚、氯仿、乙醇、SDS 等物質，且 Chelex-100 會螯合 Al、Ca、Zn、Mg、Cu、Fe、Ag、Be等常見的影響酶活性的金屬離子，在56℃水浴過程中加入PK，能夠使蛋白充分消化，減少蛋白對酶切反應的影響。100℃煮沸使蛋白變性，Chelex-100滅活，通過離心去除Chelex-100顆粒，使這些和Chelex-100結合的物質與DNA分離，以免影響下一步的酶切反應。

隨著法醫實踐中應用甲基化敏感性酶限制性內切酶-PCR法對差異甲基化聯合STR位點[6]，差異甲基化聯合SNP位點的研究越來越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復雜、步驟繁多、耗費的時間較長，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機溶劑，這些物質都會對限制性內切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡單、檢材耗費少、省時省力的特點[9]，并且該方法中用到的試劑基本無毒。在法醫工作實踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實踐中已得到廣泛的應用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應用于法醫實踐提供了依據。

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