五味消毒飲的體外抑菌實驗研究

楊宏靜，李小山，楊志波

（1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 404120；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007）

五味消毒飲出自《醫(yī)宗金鑒》，以金銀花為君藥，由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子組成，具有清熱解毒、消散疔瘡等功效，臨床上廣泛用于五官、內(nèi)科、外科、婦科等疾患[1-2]。當(dāng)前世界范圍內(nèi)抗生素的濫用及細(xì)菌的耐藥情況越來越嚴(yán)重，許多中藥方被民間用于防止感染性疾病，將中草藥中的有效成分用于臨床抗感染是一項重要課題[3]。通過中藥復(fù)方五味消毒飲的體外抑菌實驗[4]，觀察五味消毒飲對臨床常見菌群金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、白色念珠菌的抑菌效果，為中藥復(fù)方五味消毒飲的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 五味消毒飲復(fù)方藥液制備 五味消毒飲由金銀花、野菊花、紫背天葵子、紫花地丁、蒲公英組成，分別稱取上述藥材各5g，粉碎后紗布包裹，加水100ml浸泡1小時，微火加熱煮沸30分鐘，稍加冷卻過濾藥液后將藥渣按上述方法再操作一次，合并兩次濾液，60℃濃縮至5ml。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至100%的提取物水煎藥液（即每毫升藥液含原生藥1g），0.1MPa，120℃條件下滅菌15分鐘，用三蒸水做二倍稀釋，裝瓶置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、白色念珠菌均為本實驗室存留；培養(yǎng)基為抑菌實驗通用培養(yǎng)基：瓊脂培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器 垂直流超凈工作臺、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A、DH3600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計（鄭州杜甫儀器廠）、手提式高壓滅菌鍋、2D-85型恒溫振蕩器、隔水式培養(yǎng)箱（JT75-1）、TU-1800型紫外可見分光光度計、ZD-85型恒溫?fù)u床、AB204-S基礎(chǔ)型電子分析天平、高壓滅菌器等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備（1）細(xì)菌菌懸液制備。將實驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌）接種于瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)過夜后將活化菌轉(zhuǎn)種，37℃培養(yǎng)16小時，再次轉(zhuǎn)種增殖培養(yǎng)8小時，加入培養(yǎng)基校正，使其濃度約為2×107CFU/ml。（2）白色念珠菌制備。將白色念珠菌接種于沙氏培養(yǎng)基斜面，30℃培養(yǎng)48小時，將活化菌轉(zhuǎn)種培養(yǎng)16小時，再轉(zhuǎn)種于瓊脂培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)6小時，用沙氏液體培養(yǎng)基校正，使其濃度約為2×107CFU/ml。

1.2.2 擴(kuò)散法 擴(kuò)散法采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）。首先制備含有定量五味消毒飲藥液的紙片（每片含結(jié)晶紫20μl）。選用吸水力強(qiáng)的濾紙打孔制成直徑6m m圓片，高壓滅菌烘干并逐片定量加樣（五味消毒飲提取液）后置于37℃的溫度下，2小時烘干，然后同法用生理鹽水制作抗菌藥物紙片的陰性對照。紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)，測試菌的生長被抑制形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映了測試菌對五味消毒飲的敏感程度。

1.2.3 試管二倍稀釋法 取無菌試管10支，分別加入沙氏培養(yǎng)基1ml，第1管為空白對照，第2管開始加入藥液1ml，混勻，連續(xù)倍比稀釋至第9管，第10管為陽性對照。10只試管再加入菌懸液100μl，使每管最終菌液濃度約為5×106CFU/ml。其中細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌）37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18小時，白色念珠菌28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24小時。培養(yǎng)結(jié)束后每支試管中吸取100μl在適宜培養(yǎng)基上進(jìn)行平皿涂布，倒置培養(yǎng)。

1.2.4 MIC測定 將上述試管中的培養(yǎng)液，每支試管中吸取1ml移種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，以平皿上菌落數(shù)小于陽性對照為五味消毒飲對該菌種的M I C。

2 結(jié)果

2.1 涂布菌含量測定

按上述方法測定了各常見菌涂布菌液濃度。大腸埃希菌2.1×108個/ml，變形桿菌1.1×108個/ml，金黃色葡萄球菌3.7×108個 /ml，白色念珠菌 1.4×106個 /ml。

2.2 擴(kuò)散法結(jié)果

按上述擴(kuò)散法在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)菌，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及變形桿菌在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；白色念珠菌在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時，然后進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示：五味消毒飲提取液均對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、白色念珠菌有不同程度的抑制作用，見表1。

表1 五味消毒飲提取液對4種常見菌的抑制結(jié)果（mm）

2.3 試管二倍稀釋法結(jié)果

量取連續(xù)倍比稀釋的五味消毒飲提取液與稀釋菌液恒溫培養(yǎng)，玻璃皿涂板測定五味消毒飲提取液對不同菌株的M I C，結(jié)果見表2。

表2 五味消毒飲提取液對不同菌株的最小抑菌濃度

3 討論

實驗結(jié)果表明，五味消毒飲對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、白色念珠菌均有不同程度的抑菌作用，抑菌程度與M I C具有相關(guān)性，與實驗方法中藥物濃縮過程中的損耗與菌懸液最終濃度有關(guān)，更具體的原因有待進(jìn)一步研究。本實驗中試管二倍稀釋法測定中草藥提取液的M I C參考了相關(guān)文獻(xiàn)報道。培養(yǎng)基為細(xì)菌的生長繁殖提供了營養(yǎng)成分和合適的環(huán)境，可能會影響中藥體外抑菌效果。細(xì)菌在不同的培養(yǎng)基上生長性能差別較大，培養(yǎng)基的選擇和正確使用非常重要。中藥抗菌因子對細(xì)菌的抑制效果受生長環(huán)境的影響較大，培養(yǎng)基越適合，細(xì)菌生長越好，抑菌作用就越弱。培養(yǎng)基對抑菌作用的影響也反映了中藥體內(nèi)和體外抑菌效果的差異，通過體外實驗獲得的抗菌譜必須在臨床上進(jìn)一步驗證確定。

五味消毒飲雖然在體外可抑制常見菌，但這并不意味著中藥方劑功效大于單味藥，而且中藥復(fù)方制劑的作用原理在于“君臣佐使”對機(jī)體的調(diào)理，只有通過體內(nèi)實驗，才能體現(xiàn)中藥方劑的功效，所以在中藥抑菌實驗中要注重復(fù)方的研究，也應(yīng)該注重中藥在體內(nèi)的研究。

[1]朱益超.五味消毒飲治療淋病性尿道炎50例[J].實用中醫(yī)藥雜志，2003，19（6）：286-287.

[2]李波.經(jīng)效散合五味消毒飲加減治療外傷性真菌感染所致角膜潰瘍38例臨床研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2009，19（5）：286-288.

[3]舒鴻飛.五味消毒飲在皮膚科的臨床運用[J].湖北中醫(yī)雜志，2001，23（12）：224-225.

[4]錢存柔，黃儀秀.微生物學(xué)實驗教程[M].北京：北京大學(xué)出版社，2005.