督脈電針對脊髓損傷大鼠生長相關蛋白43表達的影響①

李兵奎，曾彬，常巍，王達義，楊琪，王曉勛，余連軍，劉濤

·基礎研究·

督脈電針對脊髓損傷大鼠生長相關蛋白43表達的影響①

李兵奎1a，曾彬2，常巍1a，王達義1a，楊琪1a，王曉勛1b，余連軍1a，劉濤1c

目的研究督脈電針對大鼠脊髓損傷后生長相關蛋白43(GAP-43)基因及蛋白表達的影響。方法利用多中心急性脊髓損傷打擊器建立Sprague-Dawley大鼠T11脊髓損傷模型，造模成功后分為對照組(A組，n=18)和督脈電針組(B組，n=18)。造模后1周，B組接受督脈電針治療每天1次。兩組大鼠于造模后1、2、4、8周行BBB后肢運動功能評分；造模后2、4、8周，采用RT-PCR檢測GAP-43 mRNA表達，采用免疫組化染色檢測GAP-43蛋白表達。結果造模后，與A組比較，B組BBB評分明顯升高(P＜0.01)，GAP-43 mRNA相對表達量明顯升高(P＜0.01)，GAP-43蛋白陽性表達明顯增強(P＜0.01)。結論督脈電針可促進脊髓損傷大鼠GAP-43表達。

脊髓損傷；督脈電針；生長相關蛋白43

[本文著錄格式]李兵奎，曾彬，常巍，等.督脈電針對脊髓損傷大鼠生長相關蛋白43表達的影響[J].中國康復理論與實踐, 2014,20(1):27-29.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)因其發病機制復雜、致殘率高，成為棘手的世界難題。督脈電針作為中醫傳統治療手段，在實驗研究及臨床實踐中均被證實能夠促進脊髓損傷的修復[1-4]。生長相關蛋白(growth associated protein-43,GAP-43)是一種神經細胞膜的特異性磷酸蛋白，是神經元發育、軸突生長及再生、突觸形成及重建的標志性蛋白質[5]。本實驗觀察督脈電針對脊髓損傷大鼠GAP-43基因及蛋白表達的影響，探討督脈電針治療脊髓損傷的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雌性成年SPF級Sprague-Dawley大鼠42只，體重200～250 g，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK(鄂) 2011-0008。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準[6]。

1.1.2 主要儀器及試劑 脊髓損傷打擊器(MASCIS Impactor ModelⅠ)：美國紐約大學；低頻電子脈沖治療儀(G6805-3型)：上海華誼醫用儀器有限公司；生物顯微鏡(OLYMPUS-BX40)：日本OLYMPUS公司；凝膠數字圖像分析儀(Alpha Imager TM2200)：美國Alpha Imager；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件：美國Media Cybernetics公司；總RNA提取試劑(RN0101)：北京艾德萊生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒(#K1621)： 美 國 Fermentas公 司 ；PCR試 劑 盒(PT102-01)：上海萊楓生物科技有限公司；兔抗GAP-43多克隆抗體(bs-0154R)：北京博奧森生物技術有限公司；快捷型酶標羊抗兔IgG抗體(KIT-5005)：福州邁新生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于解剖板上，術區備皮消毒。取后背部長約3 cm切口，逐層切開，切除T11椎板及棘突，顯露T11脊髓，暴露3×4 mm打擊區。將大鼠移入MASCIS脊髓損傷打擊器載物臺，鉗夾固定打擊區上下端椎骨，打擊桿自2.5 cm高度自由落下，撞擊脊髓，打擊勢能為25 gcm。術后每日常規肌肉注射青霉素105U、慶大霉素5000 U，共3 d；予以人工排尿、排便每天2次，直至大鼠排尿反射恢復。

1.2.2 動物分組及干預 共36只大鼠造模成功，分為對照組(A組)和督脈電針組(B組)，每組18只。

脊髓損傷后1周，B組采用G6805-3型低頻電子脈沖治療儀進行督脈電針治療：啟動治療儀，調試正常；將大鼠清醒狀態下固定；用直徑0.3 mm的毫針，以捻針法分別在大椎穴(C7棘突下)和命門穴(L2棘突下)緩慢進針，有突破感時停止，深度約5 mm，達硬膜外；將兩枚毫針分別與治療儀的輸出線末端電極連接，大椎穴接正極，命門穴接負極；選擇疏密波模式，頻率為密波60 Hz、疏波2 Hz，刺激強度以大鼠后肢出現輕微顫動為度，每次20 min，每天1次。

1.3 BBB后肢運動功能評分

于脊髓損傷后1、2、4、8周分別由兩名獨立觀察者(熟悉評分標準但非本組實驗人員)根據BBB評分法[7]對大鼠后肢運動功能進行評分，左右兩側下肢評分不同時取平均值，每只大鼠的評分分取兩人評分的均值。

1.4 處死取材

脊髓損傷后2、4、8周，進行BBB評分后，各組取6只大鼠處死：10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉；將大鼠俯臥位固定于解剖板上，沿背部原傷口處切開皮膚、皮下組織、筋膜和肌肉，顯露椎骨；用顯微椎板咬骨鉗逐步咬除棘突、椎板，暴露損傷區上下脊髓；T11為中心，取出長約2 cm脊髓組織；以損傷區為中心，將脊髓組織橫斷分為兩部分，一部分放入液氮保存，備RT-PCR檢測，另一部分置于標本儲存瓶中，加入4%多聚甲醛PBS溶液，固定24 h以上，備免疫組化染色。

1.5 RT-PCR檢測

應用Trizol試劑提取液氮凍存的脊髓組織標本總RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。引物序列如下：GAP-43 F 5'-GCT CTG CTA CTA CCG ATG C-3'，R 5'-TTC CTT AGG TTT GGC TTC A-3'，產物擴增長度為371 bp；β-actin F 5'-TGG TGG GTA TGG GTC AGA AGG ACT C-3'，R 5'-CAT GGC TGG GGT GTT GAA GGT CTC A-3'，產物擴增長度為265 bp。采用25 μl反應體系，反應條件：94℃3 min，1個循環；94℃30 s，55.5℃45 s，35個循環；72℃10 min，1個循環。

RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠數字圖像分析儀掃描，經凝膠圖像分析系統對產物的電泳條帶進行光密度分析，以β-actin作為內參照，計算目的基因與β-actin內參基因PCR產物電泳條帶積分光密度(integral optical density,IOD)的比值。

1.6 免疫組化染色

經甲醛固定的脊髓組織沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 μm厚切片，行GAP-43免疫組化染色(SP法)。每個標本隨機選取2張切片，每張切片于400×光鏡下選取3個視野，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量IOD，每個標本的結果取2張切片及其3個視野的平均值。

1.7 統計學分析

應用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料用(±s)表示，兩組數據間比較采用t檢驗。若方差不齊或數據資料不服從正態分布，則采用秩和檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 BBB后肢運動功能評分

脊髓損傷后次日兩組大鼠后肢運動功能均喪失，BBB評分均為0分；損傷后1周，兩組大鼠BBB評分無顯著性差異(P＞0.05)；以后各時間點，B組比A組BBB評分明顯升高(P＜0.01)；其中，脊髓損傷后8周，A組和B組大鼠BBB評分分別為(9.25±1.44)分和(13.58±1.96)分(P＜0.01)。見圖1。

2.2 GAP-43 mRNA表達

GAP-43 mRNA和β-actin電泳結果與預擴增片段長度吻合。脊髓損傷后不同時間點，B組GAP-43mRNA的相對表達量均明顯高于A組(P＜0.01)。見表1。

表1 各時間點兩組大鼠GAP-43 mRNA的表達(相對IOD)

2.3 GAP-43蛋白表達

脊髓損傷后，兩組大鼠脊髓組織內均可見GAP-43蛋白陽性表達，主要分布于軸突出芽及生長錐，呈棕黃色細絲狀。與A組比較，B組各時間點GAP-43蛋白表達均顯著增強(P＜0.001)。見表2。

表2 各時間點兩組大鼠GAP-43蛋白表達(IOD)

圖1 脊髓損傷后兩組大鼠BBB后肢運動功能評分

3 討論

脊髓損傷是中樞神經系統的嚴重創傷，常可導致患者癱瘓，使其喪失生活自理能力及勞動力。督脈電針作為一種傳統的中醫治療方法，在實驗研究及臨床實踐中均已被證實對脊髓損傷修復有促進作用[1-4]。本研究顯示，督脈電針治療能促進脊髓損傷大鼠神經功能的恢復，與文獻報道一致[1-4]。

GAP-43是一種鈣調蛋白結合的胞膜磷酸蛋白質，由神經元胞體合成，是一種神經內源性生長相關蛋白。它可以促進神經元的生長發育、軸突再生及突觸的重構，是反映中樞神經再生的標志性蛋白質[8]。GAP-43的高表達可以增強中樞神經元的生長潛能[9]；在生長錐，GAP-43可促進F-肌動蛋白的聚集，使生長錐更具有活力，從而啟動神經的發育、軸突的再生及突觸的重建[10-11]。

GAP-43基因高表達被認為是神經再生的典型特征，與脊髓再生密切相關。Storer等發現，在缺乏外源性營養因子的情況下，GAP-43能使神經長出新突起，同時可以增強神經可塑性、突觸重建及遞質釋放[12]。Metz等發現，敲除大鼠GAP-43基因后，大鼠的感覺、運動和反射功能均發生障礙[13]。

本研究顯示，督脈電針可以上調GAP-43 mRNA表達，增加GAP-43蛋白表達，從而可能增強神經可塑性，促進軸突再生及突觸重建，發揮促進脊髓損傷修復的作用。

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Effects of Du Meridian Electroacupuncture on Growth Associated Protein-43 Expression in Rats after Spinal Cord Injury

LI Bing-kui,ZENG Bin,CHANG Wei,et al.Department of Spinal Surgery,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China

ObjectiveTo study the effect of Du meridian electroacupuncture on growth associated protein-43(GAP-43)expression in rats after spinal cord injury(SCI).MethodsThe SCI models were established with MASCIS Impactor at T11segment in Sprague-Dawley rats.They were equally divided into control group(group A,n=18)and Du meridian electroacupuncture group(group B,n=18).Group B received electroacupuncture once a day since 1 week after SCI.They were evaluated with the Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)score 1,2,4,8 weeks after SCI.The mRNA and protein of GAP-43 was detected with RT-PCR and immunohistochemistry 2,4,8 weeks after SCI.ResultsCompared with group A,the BBB score,the expression of GAP-43 mRNA and protein increased in group B after SCI(P＜0.01).ConclusionDu meridian electroacupuncture can promote the expression of GAP-43 after spinal cord injury.

spinal cord injury;Du meridian electroacupuncture;growth associated protein-43

R651.2

A

1006-9771(2014)01-0027-03

2013-04-10

2013-05-02)

湖北省教育廳科學技術研究計劃重點項目(No.D20082403)。

1.湖北醫藥學院附屬太和醫院，a.脊柱外科；b.生命科學研究所；c.病理科，湖北十堰市442000；2.湖北醫藥學院附屬東風公司總醫院內科，湖北十堰市442000。作者簡介：李兵奎(1979-)，男，漢族，湖北黃岡市人，碩士，主治醫師，主要研究方向：脊柱外科。通訊作者：常巍，男，博士，主任醫師。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.01.007