術前血清miR-221水平對肝細胞肝癌R0切除術后早期復發的預測價值*

郭曉東，余靈祥，李瑞生，周艷賢，郭超楠，楊美

·短篇論著·

術前血清miR-221水平對肝細胞肝癌R0切除術后早期復發的預測價值*

郭曉東，余靈祥，李瑞生，周艷賢，郭超楠，楊美

目的探討肝細胞癌（HCC）患者術前血清miR-221水平與R0切除術后患者生存和早期復發的關系。方法選取2009年7月至2011年8月在我院行R0切除術治療的78例HCC患者，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測血清miR-221水平，并分析血清miR-221水平與HCC患者臨床和病理特征的關系。結果38例高分化HCC患者血清miR-221水平為（6.4±2.2），而39例低分化患者為[（11.5±4.3），P＜0.05]，13例血清AFP＜20μg/L患者血清miR-221水平為（5.9±3.6），而65例血清AFP＞20μg/L患者為[（9.6±2.9），P＜0.05]，而在不同性別、年齡、肝硬化有無、腫瘤大小、Child-Pugh分級間無明顯差異（P＞0.05）；78例HCC患者在R0切除術后血清miR-221相對水平（3.49±0.73）較術前（8.95±1.57）顯著降低（P＜0.05）；高水平組1 a生存率為45.3%（24/53），低水平組為72.0%（18/25，P＜0.05）；高水平組平均疾病進展時間（TTP）和中位生存期（MOS）分別為10.7個月和14.2個月，而低水平組則分別為15.3個月和19.2個月，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論血清miR-221水平與HCC患者臨床和病理特征密切相關，其術前血清高水平提示HCC患者在R0切除術后仍預后不良。

肝細胞癌；肝切除術；miR-221；預后

Hepatocellular carcinoma；Hepatectomy；miR-221；Prognosis

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上最常見的消化系統惡性腫瘤之一，每年全球大約有70萬人死于HCC[1]。手術切除腫瘤仍然是目前最有效的治療手段。R0指在顯微鏡下切緣無癌細胞的完整腫瘤切除，即所謂的根治性切除，理論上獲得R0切除的患者可以獲得較長的生存期。但由于術前或術中可能存在肝癌細胞的微轉移等原因可導致術后早期腫瘤復發[2]?！袄硐搿钡腍CC標志物有利于我們有效評估手術切除效果，以及判斷術后腫瘤復發或轉移。目前，臨床上最常用的用于HCC復發和預后的血清學標志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）存在一定的假陽性或假陰性的情況[3]。因此，尋找一種在敏感性和特異性方面都令人滿意的反映HCC預后的標志物仍是目前研究的重點和熱點。miRNA是新近發現的一類在真核生物中廣泛存在的非編碼調控單鏈小分子RNA。最新的研究顯示，血液循環中腫瘤相關miRNAs還能作為惡性腫瘤診斷的生物學標志物[4]。miR-221是目前已知的在HCC患者癌組織中高表達的miRNA，且能在血清中檢測到，與HCC的發生和預后密切相關[5]。本研究通過檢測HCC患者在R0切除術后血清miR-221水平的變化，以探討其與患者生存和早期復發或轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 病例來源選取2010年7月至2012年8月在我院行R0切除術治療的78例HCC患者，所有患者均經組織病理學檢查證實為HCC。其中男性61例，女性17例；年齡42～67歲，平均年齡（48.7±7.2）歲。術前AFP＞20 μg/L者65例，AFP≤20 μg/L者13例。所有患者均獲得完整隨訪，且未在術后30 d內死亡?；颊呒{入標準：①病灶數≤3個，腫瘤最大直徑≤10 cm；②腫瘤包膜或假包膜完整；③無肉眼可見的血管癌栓和區域淋巴結轉移；④無遠處轉移；⑤肝功能Child-Pugh A級或B級；⑥術中經超聲檢查證實剩余肝無殘留腫瘤，且病理學檢查證實手術切緣無腫瘤細胞殘留。本研究獲得患者及其家屬簽署知情同意書，并經醫院倫理委員會審核通過。

1.2 血清miR-221水平檢測應用RT-PCR法，所有患者均在R0切除術前1～3 d及術后1個月空腹采集靜脈血5 ml，置于含有促凝劑和明膠的試管中，置于室溫下1 h。然后，在3000 r/m條件下離心15 min，將上層血清轉移至潔凈的EP管中，置于-80℃冰箱待測；根據mirVana PARIS Kit（AMl 556）提取試劑盒提供的方法提取血清RNA。采用NanoDropTM測定RNA水平并評估純度，選取OD260/OD280值在1.9～2.1之間的樣本進行下一步實驗。選取U6作為內參基因，建立15 μl反轉錄體系：即dNTP 0.15 μl，Multiscribe RT enzyme 1 μl，Buffer 1.5 μl，RNase Inhibitor 0.19 μl，Nuclease free water 4.16 μl，RT Primer 3 μl，RNA 5 μl。在Gene Amp PCR System 9700上進行RT反應：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min，在反應結束后，冰上冷卻5 min，-20℃保存。Realtime PCR反應：以U6為內參基因，建立20 μl反應體系：即TaqMan miRNA Assay 1 μl，Product from RT reaction 2 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10 μl，Nuclease free water 7 μl。反應條件設置為：95℃，3 min；再95℃，15 s；60℃，30 s；72℃，30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法分析miR-221水平。

1.3 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量資料采用（±s）表示，各組間數據差異分析采用配對t檢驗，采用Kaplan-Meire法計算TTP和OS，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者不同臨床和病理學因素情況下血清miR-221水平比較經RT-PCR擴增，曲線為典型的“S”型，其融解曲線成單峰，表明擴增產物單一。將PCR擴增后的終產物進行凝膠電泳，結果顯示為單一清晰的條帶，大小和設計片段相同，證實為特異性擴增。RT-PCR結果顯示，HCC患者血清miR-221水平在不同AFP水平和腫瘤分化程度方面存在顯著的統計學差異（P＜0.05），而在不同性別、年齡、肝硬化有無、腫瘤大小、Child-Pugh分級間無明顯差異（P＞0.05，表1）。

表1 HCC患者術前血清miR-221水平分層分析

2.2 R0切除術前后HCC患者血清miR-221水平變化HCC患者在R0切除術前血清miR-221水平的相對值為（8.95± 1.57），在R0切除術后1 m，HCC患者血清miR-221水平的相對值為（3.49±0.73），較術前明顯降低（P＜0.05）。

2.3 R0切除術前血清miR-221水平與患者預后的關系術后隨訪患者至2013年10月，平均隨訪（23.7±7.4）個月，中位隨訪時間為21個月。按術前HCC患者血清miR-221水平分組，將78例HCC患者分為miR-221高水平組53例和低水平組25例。至隨訪截止時，高水平組1 a生存率為45.3%（24/53），低水平組為72.0%（18/25，P＜0.05）；高水平組平均疾病進展時間（TTP）和中位生存期（MOS）分別為10.7個月和14.2個月，而低水平組則分別為15.3個月和19.2個月，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

由于患者在術前或者術中可能有腫瘤細胞通過血液和/或淋巴系統轉移至遠處組織器官而成為術后復發的根源，因而即使是R0切除，術后也存在早期腫瘤復發的問題。如果能在早期發現腫瘤復發并及時采取治療，可以延長患者的生存時間，改善預后[6]。AFP是最常用的預測HCC術后復發的指標。研究顯示[7]，血清AFP＞20 μg/L是HCC根治性切除術后早期復發的風險因素之一。然而，大量的臨床數據顯示，HCC患者血清AFP水平不盡相同，甚至存在AFP陰性的HCC患者[8]。此外，肝炎、肝硬化、生殖細胞腫瘤、胰腺癌或肺癌等患者亦可出現不同程度的AFP升高。因此，單純依靠AFP不利于HCC的早期診斷和判斷術后早期復發或轉移[9]。

miRNA是一類長度為20～25 nt，不編碼蛋白質的單鏈小RNA。miRNA能夠與靶基因mRNA的3'-UTR（untranslated region）區的堿基互補配對，使其降解或抑制其表達，從而導致特定基因的沉默，進而參與機體各種重要的生理和病理過程。最近的研究發現，miRNA在腫瘤的早期診斷和治療等方面表現出良好的潛能。血清腫瘤相關miRNA與腫瘤的發生、發展、復發、轉移以及預后密切相關[10]。miR-221是新近發現的一個腫瘤相關miRNA，其在肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中表達均明顯上調[11～13]，其致癌機理可能通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的表達，來調節細胞周期和增殖能力，抑制細胞分化和凋亡，從而促進腫瘤的發生和發展[14～15]。

本研究將HCC患者血清miR-221水平與HCC臨床和病理因素之間的關系進行比較分析發現，HCC患者血清miR-221水平在AFP和腫瘤分化程度方面差異有統計學意義，提示血清miR-221與HCC的發生和腫瘤惡性程度存在一定的關聯，這與前面相關文獻的報道是一致的，也間接驗證了miR-221具有抑制腫瘤細胞分化的能力。

HCC患者術后早期復發的預測對于提高HCC患者手術治療效果有著至關重要的意義。我們將術前HCC患者分成miR-221高水平組和低水平組，通過隨訪發現，術前血清miR-221高水平提示較高的早期復發可能，且其平均疾病進展時間和中位生存期也明顯低于低水平組，提示血清miR-221水平在判斷HCC預后上有一定的意義。因此，對于術前血清miR-221高水平患者，術后應積極進行系統治療，并嚴格監測腫瘤的復發情況，及早發現并進行必要的處理。

[1]Block T，Mehta A S，London W T.Hepatocellular carcinoma of the liver.Cancer Biomark，2010，9（1-6）:375-383.

[2]吳力群，王祖森，胡維昱，等.528例原發性肝細胞癌患者肝切除術后1年生存分析.中華普通外科雜志，2012，27（2）:92-95.

[3]王紅陽.肝癌診斷與預后判斷的分子標志物.中華肝臟病雜志, 2011，19（4）:241-243.

[4]JuJ，JiangJ，FeslerA.miRNA:thenewfrontierincancer medicine.Future Med Chem，2013，5（9）:983-985.

[5]Li J，Wang Y，Yu W，et al.Expression of serum miR-221 in human hepatocellular carcinoma and its prognostic significance. Biochem Biophys Res Commun，2011，406（1）:70-73.

[6]吳育連，蘇昆侖，董鑫，等.肝癌切除術后早/晚期復發的危險因素與治療.中華肝膽外科雜志，2006，12（6）:370-373.

[7]Moriguchi M，Takayama T，Higaki T，et al.Early cancer-related deathafterresectionofhepatocellularcarcinoma.Surgery，2012，151（2）:232-237.

[8]王潔，孟運運，汪茂榮.血清AFP，GGT-Ⅱ和GGT聯合檢測診斷原發性肝癌的價值探討.實用肝臟病雜志，2012，15（6）: 545-547.

[9]王壽明，高蕾，于樂成，等.甲胎蛋白異質體對肝癌診斷及療效評估價值研究進展.實用肝臟病雜志，2011，14（6）:479-481.

[10]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（30）:10513-10518.

[11]Pineau P，Volinia S，Mcjunkin K，et al.miR-221 overexpression contributes to liver tumorigenesis.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（1）:264-269.

[12]DiLeva G，GaspariniP，PiovanC，etal.MicroRNAcluster 221-222andestrogenreceptoralphainteractionsinbreast cancer.J Natl Cancer Inst，2010，102（10）:706-721.

[13]Kawaguchi T，Komatsu S，Ichikawa D，et al.Clinical impact of circulatingmiR-221inplasmaofpatientswithpancreatic cancer.Br J Cancer，2013，108（2）:361-369.

[14]le Sage C，Nagel R，Egan D A，et al.Regulation of the p27（Kip1）tumor suppressor by miR-221 and miR-222 promotes cancer cell proliferation.EMBO J，2007，26（15）:3699-3708.

[15]雷永紅，呂文平，王海，等.肝細胞癌患者血清miR-221和miR-122的檢測及其臨床意義.河北醫科大學學報，2013，34（5）:522-525.

（收稿：2013-12-30）

（校對：陳宗炳）

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.028

國家“十二五”重大專項（2012ZX10002003-004-006）

100039北京市解放軍第三〇二醫院

郭曉東，男，32歲，醫學碩士，主治醫師。主要從事肝病診斷與治療工作。E-mail:guoxd_1981@163.com

Serum miR-221 levels predicts short-term survival after R0 resection in patients with hepatocellular carcinomaGuo Xiaodong，Yu Lingxiang，Li Ruisheng，et al.302nd Hospital，Beijing 100039