產纖維素酶芽孢桿菌10768原生質體紫外誘變探討

鐘麗娟，趙新海，池景良，張慶華，朱巍巍，關艷麗

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000)

利用原生質體進行微生物遺傳育種是近幾十年來迅速發展的一種育種技術，其基本實驗方法已較成熟，主要集中在原生質體制備及再生、紫外及化學誘變、原生質體融合與轉化等方面。應用原生質體誘變技術改造微生物菌種在實踐中取得了顯著成果，例如通過原生質體紫外誘變提高相關菌種產紫杉醇、蘇云金毒素、谷胱甘肽、α-淀粉酶等微生物代謝產物的能力［1］。作者對秸稈生物降解產品的生產菌株10768進行原生質體紫外誘變，比較了突變菌株的剛果紅透明圈大小和纖維素酶活力，旨在篩選出高產纖維素酶的菌株，為下一步菌種選育及菌株改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

LCCC10768由遼寧省微生物菌種保藏中心提供，該菌株為遼寧省微生物科學研究院自主研發的秸稈生物降解菌種，產品已獲得農業部微生物肥臨時登記證 (2011臨字1374號)。

1.2 原生質體制備

取進入對數生長期的菌種以1%的接種量轉入LB液體培養基中，30℃，180 r·min-1振蕩培養3 h后，加入4 U·mL-1青霉素鈉溶液繼續培養2 h，3000 r·min-1離心10min收集菌體，用高滲磷酸緩沖液洗滌2次，調整菌體濃度至108個·mL-1，吸取菌液 10mL，3000 r·min-1離心5min，加入5mL溶菌酶緩慢混合均勻，置于37℃溫水浴中保溫酶解，每隔30min取樣鏡檢，至大部分菌體破壁，釋放出原生質體即停止酶解。酶解結束后，3000 r·min-1離心10min，用高滲磷酸緩沖液洗滌2次以清除酶液，將原生質體重新懸浮于滲透壓穩定液SMM中［2］，用血球計數板計數，計算原生質體形成率［3-6］。

1.3 原生質體紫外誘變

將制備好的原生質體用SMM稀釋至106mL-1，取5mL于無菌培養皿中，將培養皿置于磁力攪拌器上，調整距離為30 cm，紫外燈照射劑量分別為30 s，60 s和120 s，照射的同時進行磁力攪拌［7］。

1.4 原生質體再生

在暗室條件下，將經過紫外誘變的原生質體分別用SMM和無菌水進行梯度稀釋，輕輕吸放于DM3琥珀酸鈉再生培養基［8］上 (下層加入2%瓊脂，上層加入0.5%瓊脂，提前一天倒好再生培養基的下層，以使表面干燥)，緩慢倒入培養基上層，混合均勻，每處理重復3次，放置于紙箱中避光，30℃恒溫培養。將未進行紫外誘變的原生質體用SMM稀釋后吸放于再生培養基上培養，3次重復，用于計算紫外致死率。

其中，A為未誘變的原生質體再生菌落數，B為SMM稀釋的紫外誘變原生質體菌落數。

其中，B為SMM稀釋后再生菌落數，C為水稀釋后生長菌落數，D為血球計數器法測得的原生質體數。

將經過紫外照射60 s，將DM3培養基上生長出的菌落挑至LB平板培養基上，劃線純化保存。

1.5 剛果紅透明圈法初篩

將突變菌株點接至CMC-Na培養基上，30℃恒溫培養48 h，用游標卡尺測定菌落直徑后，倒入10mg·mL-1剛果紅染色1 h后，用1 mol·L-1NaCl溶液沖洗，測定透明圈直徑。

1.6 突變菌株液體產酶活力測定

將供試液體菌株以2%接種至秸稈粉培養基中，30℃，180 r·min-1振蕩培養120 h后，將培養液轉于7000 r·min-14℃條件下離心10min，上清液即為粗酶液。產酶活力測定方法參照吳紅艷等［9］。

2 結果與分析

2.1 紫外誘變劑量對菌株10768原生質體致死率的影響

不同紫外誘變劑量對10768原生質體致死率的影響見表1，隨著誘變劑量增加，致死率升高，據文獻報道，致死率在70%～80%時存活菌變異現象顯著，正突變率高，誘變效果好。因此選擇10768原生質體的紫外誘變劑量為60 s。

表1 紫外誘變劑量對原生質體致死率及再生率的影響

2.2 突變菌株剛果紅透明圈法初篩結果

利用紫外突變，共分離出97株菌株，分別點接至CMC-Na培養基上，其中11株透明圈較大，其透明圈直徑/菌落直徑均大于原始菌株，測定結果見表2。UV09，UV14和UV22的比值較大，選擇這3個菌株為優良突變株進行纖維素酶酶活的測定。

表2 原生質體再生突變株剛果紅透明圈法測定結果

2.3 突變菌株液體培養物纖維素酶活測定結果

供試的3株突變菌株的纖維素酶活力測定結果見表3。透明圈大的突變株，其在液體培養基中纖維素酶活也高，其中UV22的纖維素酶活較原始菌株提高了51%。

表3 突變菌株固體培養物纖維素酶活測定結果

3 小結與討論

本文主要研究了秸稈生物降解菌株10768的原生質體紫外誘變劑量及其突變株纖維素酶活力。雖然原生質體制備的試驗技術已相當成熟，但不同菌株生理特性各異，原生質體制備條件不盡相同，本研究在原生質體制備中加入了4 U·mL-1青霉素，縮短了試驗周期;所獲得的97株突變株有3株透明圈直徑/菌落直徑的比值大于4.38，纖維素酶活力較原始菌株提高30%以上，尤其是UV22的纖維素酶活力增加了50.90%。本試驗結果表明原生質體紫外誘變技術是進行菌種選育的有效手段，后續還將開展突變菌株產酶穩定性的研究。隨著原生質體技術的發展，微生物的原生質體融合及轉化技術也已日漸成熟［10］，融合2株乃至多株菌株從而獲得多個優良性狀的生產菌種是微生物菌種選育今后的努力方向。

［1］丁曉兵，李宗偉，劉曉波，等.原生質體誘變在工業微生物育種中的應用進展［J］.食品工業科技，2008(7):260-262.

［2］張克旭，陳寧，張永志，等.用原生質體融合技術選育谷氨酸高產菌［J］.微生物學報，1991，31(2):108-114.

［3］袁鑄，王忠彥，胡承，等.地衣芽孢桿菌JF-20菌原生質體的形成及其再生的最佳條件［J］.四川大學學報:自然科學版，2001，38(5):723-727.

［4］涂永勤，肖崇剛.蠟質芽孢桿菌(Bacillus cereus)原生質體形成與再生條件研究 ［J］.生物學雜志，2005，22(5):17-19.

［5］王媛媛，段玉璽，陳立杰，等.枯草芽孢桿菌 Snb2原生質體制備和再生研究 ［J］.沈陽農業大學學報，2011，42(1):110-113.

［6］鄭重誼，譚周進，肖克宇，等.不同因素對兩株細菌原生質體制備的影響［J］.生物技術通報，2007(5):131-135.

［7］謝鳳行，張峰峰，周可，等.原生質體誘變選育高纖維素酶活性枯草芽孢桿菌的研究 ［J］.華北農學報，2010，25(5):211-214.

［8］劉新梅，高宇，趙靜，等.納豆菌原生質體制備與再生條件的研究 ［J］.食品科學，2007，28(5):231-236.

［9］吳紅艷，王智學，陳飛，等.有機物料腐熟劑中纖維素酶活力測定方法的驗證 ［J］.微生物學雜志，2011，31(4):107-109.

［10］王登宇，臧威，孫劍秋，等.細菌原生質體融合育種技術及其應用進展［J］.中國釀造，2008，184(7):1-6.