試驗用和臨床用紫杉醇誘導肝癌細胞凋亡的比較

摘要

[目的]為了探討試驗用和臨床用紫杉醇對肝癌HepG2 細胞凋亡誘導作用的差異。[方法]用不同濃度的試驗用和臨床用紫杉醇處理肝癌HepG2培養(yǎng)細胞后，通過顯微觀察和流式細胞術檢測其細胞凋亡。[結果]臨床用紫杉醇在終濃度為0.5、1.0和2.0 mg/ml時，24 h非常顯著性誘導細胞凋亡，48 h誘導細胞凋亡更劇烈。試驗用紫杉醇24 h在終濃度為2.5、5.0和10.0 mg/ml時，非常顯著誘導細胞凋亡；當試驗用紫杉醇濃度為2.5 mg/ml時，48 h誘導細胞凋亡更劇烈。當試驗用紫杉醇濃度為5和10 mg/ml細胞凋亡率逐步變低，可能走向死亡。[結論]在誘導肝癌細胞凋亡中，試驗用紫杉醇要比臨床所用紫杉醇的濃度要高。

關鍵詞紫杉醇；肝癌細胞HepG2 ；細胞凋亡；流式細胞術

中圖分類號S857.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）06-01711-03

Abstract[Objective] In order to explore the difference of experimental or clinically used paclitaxel in inducing hepatoma HepG2 cell apoptosis. [Method] The cells were cultured in PRMI1640 medium and treated with experimental or clinically used paclitaxel in the different concentrations. The apoptosis in the cells was detected with the light microscope and the flow cytometry. [Result] With the treatment of the clinical used paclitaxel in the final concentration of 0.5， 1.0， 2.0 mg/ml， the apoptosis can be induced very significantly in 24 hours， the cell apoptosis induced by 48 hours more intense. With experimental paclitaxel for 24 hours at a final concentration of 2.5， 5.0， 10.0 mg/ml， the apoptosis can be induced very significantly in 24 hours； 2.5 mg/ml， apoptosis induced more intense by 48 hours. With the experimental paclitaxel concentration is 5.0， 10.0 mg/ml， the rate of cell apoptosis gradually becomes low， the cells may lead to death. [Conclusion] The concentration of experimental paclitaxel is higher than the clinically used paclitaxel in inducing hepatoma cell apoptosis.

Key words Paclitaxel； Human hepotoma cell line HepG； Apoptosis； Flow cytometry

紫杉醇是一種天然的抗癌新藥，從紅杉屬植物紫杉的樹皮和樹干中提取，具有獨特的結構和作用機制，可以阻抑細胞周期于G2/M期并誘導細胞凋亡[1]。 但是，試驗用和臨床用紫杉醇誘導肝癌細胞凋亡的差異鮮有報道。為此，筆者對試驗用和臨床用紫杉醇誘導肝癌細胞凋亡進行了比較研究。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)、藥物及處理

肝癌細胞系HepG2由中國醫(yī)學科學院提供，用含10%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基接種細胞，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，換成含0.5、1.0、2.0 mg/ml終濃度臨床用紫杉醇的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。試驗用紫杉醇的濃度由低到高直到出現明顯凋亡現象。臨床用紫杉醇注射液（Paclitaxel injection），批號為12121111，主要成分為紫杉醇。輔料為純化聚氧乙烯基蓖麻油35、無水乙醇，均由揚子江藥業(yè)集團有限公司生產。試驗用紫杉醇（Paclitaxel），批號為A0177 （DMSO溶解后以細胞培養(yǎng)基稀釋至適宜濃度供實驗用）。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 凋亡細胞的檢測

1.2.1

顯微觀察。光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，同時進行顯微照相，觀察產生凋亡細胞的情況。

3討論

傳統上，通過光學顯微鏡觀察可以檢測細胞的凋亡。流式細胞術作為一種高新技術，為細胞凋亡研究提供了有效的技術手段。該技術可針對細胞在凋亡時產生的一系列形態(tài)學、生物化學及分子生物學性質的變化，胞質Ca2+濃度升高，DNA片段化及含量變化等特點，進行定性、定量分析，從而實現對細胞凋亡的準確測定[1]。紫杉醇（Paclitaxel）是來源于紅豆杉屬植物的一種二萜類化合物，是20世紀發(fā)現的一種高效廣譜癌癥化療藥物[2]。它是一種高效微管蛋白抑制劑，與先前發(fā)現的微管抑制劑作用靶點和機制均不同，作用于微管蛋白β亞基N端第31 位氨基酸，促進微管聚合并穩(wěn)定微管結構，阻止其解聚成亞單位，進而影響微管聚合與解聚的動態(tài)平衡，阻礙紡錘絲的形成，導致細胞周期阻斷于G2/M期，從而導致細胞凋亡或死亡，同時還可以改變細胞膜超微結構，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但由于紫杉醇的水溶性很差，只能溶于聚氧乙烯蓖麻油或乙醇等有機溶劑中。因此，最廣泛的臨床制劑為紫杉醇注射劑，現臨床應用的紫杉醇注射液為由聚氧乙烯蓖麻油，無水乙醇（體積比為50∶50）制成的無色黏稠狀濃溶液[3-6]。微管是真核細胞的一種組成部分，其功能是構成細胞的網狀支架，維持細胞形態(tài)，參與細胞的收縮偽足運動，參加細胞器的位移及胞內物質運輸等，其中尤為重要的染色體的分裂和位移需要在微管的幫助下進行。正常情況下。微管和微管蛋白二聚體之間存在動態(tài)平穩(wěn)。微管在鈣離子的作用下解聚。有絲分裂時形成紡綞體和紡綞絲。牽引染色體向兩極移動[7]。紫杉醇依賴性地、可逆地結合在微管下，誘導和促進微管蛋白的聚合，穩(wěn)定微管、防止解聚。導致染色體斷裂并抑制細胞復制和移行，而阻礙腫瘤細胞復制。高濃度及低濃度紫杉醇抑制細胞有絲分裂和增生的作用機制并不完全相同， 在高濃度（血清濃度0.45 μmol/L）下增加微管二聚體的數量和聚合速度， 促進微管束的形成； 在低濃度（<10 nmol/L）下抑制胞質微管的解聚， 增加其動力學穩(wěn)定性。臨床應用的主要是紫杉醇注射液， 即由乳浮EL （Cremophor EL， 含聚氧乙烯蓖麻油）/無水乙醇（50∶50）制成的無色黏稠狀濃溶液， 使用時用5%右旋糖酐或生理鹽水稀釋成0.3～1.2 g/L溶液后靜脈滴注3～24 h，輸注劑量為135～ 175 mg/ml，最大耐受劑量（MTD） 為3 h內輸注225～ 240 mg/ml[8]。

筆者通過顯微觀察發(fā)現以含0.5、10和20 mg/ml臨床用紫杉醇的培養(yǎng)基處理肝癌細胞HepG2，24 h后見到細胞形態(tài)非常明顯變化的發(fā)生，許多細胞變圓，細胞質和染色質濃縮，細胞膜彎曲，呈小泡狀；細胞核碎裂形成典型的凋亡小體。紫杉醇處理肝癌細胞48 h后，細胞凋亡細胞數進一步增多，正常細胞數減少，細胞脫落而懸浮于培養(yǎng)基中；少數細胞體積增大、膜破裂而呈細胞壞死狀。試驗用紫杉醇的濃度十幾到幾十倍濃度時，細胞才能出現以上狀況。這可能是由于試驗用的紫杉醇沒有充分溶解所致。臨床用紫杉醇中含有助溶劑使其充分溶解，其誘導細胞凋亡的作用得以充分發(fā)揮。筆者通過流式細胞術分析發(fā)現，臨床用紫杉醇在終濃度為0.5、10和20 mg/ml時，24 h就可顯著誘導細胞凋亡。試驗用紫杉醇在24 h終濃度為2.5、50、100 mg/ml時，才可非常顯著地誘導細胞凋亡。48 h，試驗用紫杉醇在終濃度為25 mg/ml時誘導細胞凋亡更劇烈，凋亡細胞比率更高；當試驗用紫杉醇終濃度為5 mg/ml細胞凋亡率變低，但和對照相比較仍有顯著性差異 ；10 mg/ml細胞凋亡率更低，并且與對照沒有顯著性差異。這說明試驗用紫杉醇需要高濃度時才能誘導細胞凋亡。但是，隨著濃度的增高和時間的延長，凋亡細胞逐漸變少，可能更多細胞走向死亡的結果。

為了解決紫杉醇的溶解性等問題，更好地進行臨床用藥，已經開展了許多研究。有人利用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（Poly lactide—co—glycolic acid，PLGA）納米粒作為紫杉醇的載體，力求發(fā)現一種簡單高效的新型紫杉醇載藥體，他們研制載紫杉醇聚乳酸聚乙醇酸共聚物納米粒，載紫杉醇聚乳酸聚乙醇酸共聚物納米粒子可明顯誘導細胞凋亡，且有明顯的量效和時效關系，質量濃度越高、時間越長效果越明顯[2]。利用納米技術可使紫杉醇與白蛋白納米粒子結合，除了可以減輕有機溶劑對腎和神經組織的毒性即降低有機溶劑所致超敏反應發(fā)生率外，白蛋白受體還可以提高藥物向腫瘤細胞的靶向輸送[3]。解決這個問題主要有2種途徑[4]：①在其化學結構上進行修飾，增加其水溶性。由于紫杉醇極微小的結構變化都會對其與微管蛋白的結合活性有較大影響，因而修飾時必須慎重。②采用脂質體劑型，以脂質體為載體，將紫杉醇包封于其中，使水不溶性的紫杉醇易溶于生理鹽水或5%葡萄糖注射液。這不僅便于臨床用藥，更重要的是避免了因使用Cremophor EL而引起的過敏反應。脂質體屬于超微粒藥物載體，具有淋巴系統定性，可以通過內吞作用進入溶酶體，然后被酶消化而放出藥物也可以通過細胞融合作用，即脂質體膜材料與細胞膜構成物相似，而融合進入細胞內，被消化后釋放藥物，使藥物在靶區(qū)組織中維持較高濃度，以提高抗癌藥物的生物利用度。最近Tatebe等發(fā)現紫杉醇能導致細胞凋亡 ；KavalIaris等報道紫杉醇抑制卵巢上皮腫瘤與改變特定 β—tubulin基因的表達有關；Vater等通過電鏡和掃描顯微鏡發(fā)現任Ca2+和紫杉醇存在下，微管蛋白的聚合發(fā)生畸變而且這種畸變結構隨著加入紫杉醇和Ca2+的順序不同而有所不同。改善其水溶性的最常用方法是制備其衍生物：側鏈C-2位羥基酯化在體外試驗活性較差。體內試驗表明對活性影響不大，說明酯化產物在體內水解成羥基，封閉該位使活性喪失，因此C-2 的酯化是尋找前藥的有效途徑。修飾原則為：功能基在活化條件下應能自行從結合物下脫落，產生紫杉醇；新引入的基團能增加該化合物的水溶性[7]。紫杉醇藥物釋放支架和白蛋白納米粒注射液相繼被FDA 批準上市，是紫杉醇制劑研究的成功例證。國內外尚有乳劑、納米粒、脂質體和聚合膠束（Genexol）等制劑進入臨床試驗，有希望成為下一代臨床藥物。紫杉醇未來制劑的研發(fā)重點將集中在紫杉醇局部或靶向緩控釋制劑。同時由于制劑技術的改進，紫杉醇口服給藥將獲得突破[8]。

42卷6期單長民等試驗用和臨床用紫杉醇誘導肝癌細胞凋亡的比較

近期有人開發(fā)了一種攜帶紫杉醇（PTX）的膠束，由簡單的共軛于聚乙二醇5000配方（PEG5K）和恩貝酸（EB）而成。恩貝酸是一種天然產物，通過阻斷活性X連鎖凋亡蛋白抑制劑（XIAP）具有抗腫瘤活性。PEG5K-EB2共軛自組裝形成穩(wěn)定的在水溶液中的膠束并有效封裝疏水性藥物紫杉醇。體外細胞攝取研究表明PEG5K-EB2膠束被腫瘤細胞有效吸收。體外釋放研究表明PTX存在于PEG5K-EB2膠束中。PTX慢慢釋放超過5 d，比紫杉醇制劑的釋放慢得多。在幾個培養(yǎng)的腫瘤細胞系中形成PEG5K-EB2膠束的 PTX比單獨紫杉醇形式表現出更強的細胞毒性。近紅外熒光（NIRF）成像整體上PEG5K-EB2膠束有選擇性地富集在主要器官的腫瘤部位，包括肝臟和脾。PEG5K-EB2膠束中PTX表現出良好的安全性與最大耐受劑量，20～100 mg PTX/kg的小鼠，顯著高于紫杉醇（15～20 mg PTX/kg）。最后，與在乳腺癌和前列腺癌的小鼠模型中的紫杉醇相比，制成的PEG5K-EB2膠束的PTX表現出優(yōu)異的抗腫瘤活性[9]。

參考文獻

[1]

娜仁圖娜拉，閆雷，趙瑞杰.流式細胞術及其在細胞凋亡檢測中的應用[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（27）：5353-5356.

[2] 龐麗云，王海，陳永霞.載紫杉醇聚乳酸聚乙醇酸共聚物納米粒抑制人肝癌細胞HepG2的作用[J].中國組織工程研究，2013（3）：412-418.

[3] 趙君賢.納米粒子的靶向作用機制研究進展[J].中國醫(yī)藥生物技術，2007（5）：370-372.

[4] 黃洪標，周萍，趙燦國.漆樹酸聯合紫杉醇對肝癌細胞生長抑制和凋亡的影響[J].實用醫(yī)學雜志，2013，29（7）：1044-1047.

[5] 高飛，龐容清，鄒浩，等.紫杉醇對高轉移性肝癌細胞株MHCC97-H中ezrin表達的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2013，29（2）：157-160

[6] 周曉蕾，李芝芬.紫杉醇研究概況[J].保定師專學報，1999，12（2）：43-47.

[7] 翁開敏，賀全山.紫杉醇研究概況[J].海峽藥學，2002，14（2）：5-7.

[8] 梅林，孫洪范，宋存先.紫杉醇制劑研究進展[J].中國藥學雜志，2006，41（18）：1366-1370.

[9] LU J Q，HUANG Y X，ZHAO W C，et al.PEG-derivatized embelin as a nanomicellar carrier for delivery of paclitaxel tobreast and prostate cancers[J].Biomaterials，2013，34： 1591-1600.