軟脂酸對腎小管上皮細胞TLR4表達的影響

張鑫等

[摘要] 目的 通過研究軟脂酸（PA）對腎小管上皮細胞Toll樣受體4（TLR4）表達的影響，初步探討游離脂肪酸（FFA）在引發腎臟微炎癥反應的相關作用機制。方法 體外培養大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E），采用不同濃度軟脂酸進行干預，用RT- PCR法檢測12 h、24 h后腎小管上皮細胞TLR4 mRNA水平，ELISA方法檢測24 h后IL-6、TNF-α的表達。結果 軟脂酸組的TLR4、IL-6、TNF-α表達較對照組均明顯升高，且呈現一定的濃度依賴趨勢（P<0.05）。結論 軟脂酸可能是通過刺激腎小管上皮細胞表達TLR4而促進腎臟炎癥反應。

[關鍵詞] 軟脂酸；腎小管上皮細胞；Toll樣受體-4

[中圖分類號] R692.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）09-0025-03

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的一種常見的、后果嚴重的微血管并發癥，由于其發病機制極其復雜，迄今尚未完全闡明。近年研究表明：高血糖、炎癥、脂毒性、腎小球血流動力學改變、蛋白質的非酶糖基化、凝血機制異常等多種因素都參與了DN的發生發展，其中炎癥因素在DN 的發生發展中起關鍵作用， 許多炎癥因子甚至在DN中發揮致病作用[1]。Toll樣受體4（Toll like receptor-4，TLR4）是引發炎癥反應的關鍵跨膜蛋白，能夠誘導NF-κB激活，啟動IL-1、IL-6、TNF-α和輔助刺激因子CD80、CD86等基因的轉錄，引起腎小管上皮發生微炎癥反應。同時，有關研究表明，脂代謝異常在DN發生發展中也起著重要作用。相關文獻指出：脂代謝異常是2型糖尿病及其并發癥的基本病理生理改變[2]，可產生大量游離脂肪酸（free fatty acids，FFA），而高濃度的FFA聚集在腎間質可導致嚴重的腎小管及其周圍間質損傷[3]。但是關于FFA是通過什么途徑導致腎小管及其周圍腎間質損傷，是否是通過刺激或激活炎癥通路的相關受體達到促進腎臟炎癥反應，加速腎臟損害，目前國內外鮮有相關報道。

本文通過研究高軟脂酸（palmitic acid，PA）（人體內含量最高的FFA之一）環境下腎小管上皮細胞TLR4 的表達情況及其信號通路下游炎癥因子的分泌情況，初步探討游離脂肪酸與糖尿病腎病早期腎小管及周圍間質微炎癥之間的關系。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑

正常SD大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）（博士德，武漢），軟脂酸（Gibco，USA），去脂牛血清白蛋白（d-BSA）（sigma，USA），DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶（博士德，武漢），TRIZOL試劑、一步法cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒（Takar，日本），IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（博士德，武漢）。

1.2 細胞培養

采用含10%胎牛血清的DMEM 為NRK-52E細胞的培養液，在含5%CO2濃度37℃恒溫培養箱內孵育，每2～3天換液并傳代接種，傳代前PBS液漂洗，0.25%胰酶消化。細胞傳至第四代處于生長對數期時進行下述實驗，每個實驗重復3 次。

1.3 實驗分組

實驗共設立五組：（1）對照組設兩組：①正常培養液組（不施加任何干預措施），②0.5%d-BSA+ 正常培養液組。（2）根據軟脂酸干預濃度不同，將實驗組分為三組： PA125 μmol/L組、PA250 μmol/L組、PA500 μmol/L組，以去脂牛血清白蛋白（d-BSA）為溶解軟脂酸的載體，（各組載體d-BSA含量為0.125%、0.25%、0.5%）。

1.4方法

1.4.1 RT-PCR 法檢測TLR4mRNA 的表達 用按1mLTrizol/107細胞提取總RNA，利用紫外分光光度法對其定量，0.7%瓊脂糖凝膠檢查RNA完整性。按照cDNA合成試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA。每組各取逆轉錄產物2 μL進行PCR 擴增，反應條件：預變性，95℃ 30 s 1次； PCR反應95℃ 3 s，60℃ 30 s 40次。cDNA 擴增所使用的引物包括：TLR4正意鏈引物5-CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3， 反意鏈引物5-GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3， 擴增產物長 177bp；β-actin 正意鏈引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'， 反意鏈引物5-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3， 擴增產物長150 bp。引物委托日本Takar有限公司合成。采用 ABI7300 型擴增儀圖像處理系統分析熒光信號并將其轉換成Ct 值，計算公式： 相對mRNA 表達=2-ΔΔCt，其中ΔCt 值=靶基因Ct 值-Actin Ct 值。ΔΔCt 值=實驗組ΔCt-對照組ΔCt。

1.4.2 ELISA法檢測IL-6、TNF-α的表達 細胞干預達終點后收集上清液，具體實驗步驟參照試劑盒說明書，以酶標儀在450 nm測定OD值，根據標準曲線及OD值計算各樣本的相應濃度。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0 統計軟件，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，多個樣本均數間先進行單因素方差分析，之后兩兩之間采用LSD最小顯著差異法比較；兩樣本均數間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測NRK-52E細胞TRL4表達結果

不同濃度的軟脂酸處理腎小管上皮細胞12 h、24 h后，與對照組相比mRNA表達上調，并隨濃度增高而增加，且差異有統計學意義（P <0.05）；相同濃度組不同時間段比較，24 h較12 h表達有所增高，且中、高濃度組均有統計學差異（P <0.05），見表1。提示在0 μmol/L～500 μmol/L濃度的軟脂酸之間，其刺激TLR4的表達在12 h及24 h有一定濃度依賴趨勢，見圖1。

2.2 ELISA檢測NRK-52E細胞IL-6、TNF-α分泌情況

IL-6：低濃度組與空白對照組、dBSA對照組比較，IL-6的分泌無統計學差異（P>0.05）；而中、高濃度組與空白組、dBSA對照組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05），并呈現一定的濃度依賴增長趨勢。TNF-α：各組實驗組與對照組相比，TNF-α分泌量均明顯增高，且差異有統計學意義（P < 0.05）；其中低、高濃度組相比及中、高濃度組相比較，差異有統計學意義（P <0.05），并且分泌量隨著PA濃度的增高而增加。見表2。

3 討論

近年來，糖尿病發病率伴隨著經濟發展、人們生活方式改變及人口老齡化日趨升高，其諸多并發癥亦較前明顯增多，其中糖尿病腎病為其重要并發癥之一。越來越多的研究表明，促炎癥因子和FFA在DN的發生發展中起了重要作用[4]。一方面，1991年Hasegawa等[5]首次證明了炎癥因子（IL-1、TNF-α）在糖尿病腎病的發展中起重要作用。近年來，Dalla等[6]發現2型糖尿病患者體內的IL-6、C反應蛋白（CRP）、纖維蛋白原等炎癥因子與促進腎臟結構破壞、基底膜增厚有關。而Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）作為介導免疫和炎癥反應的主體，被認為是將細胞外抗原識別信息向細胞內傳遞并引發炎癥反應的關鍵跨膜蛋白，近些年研究發現，其主要通過NF-κB途徑，激活并啟動IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等基因的轉錄和表達。同時，在關于DN的體內實驗中發現，腎小管上皮細胞有TLR4的高表達[7]，此外，有研究還發現TLRS在腎小球硬化、腎間質纖維化的發生、發展中起重要作用[8-10]。劉抗寒等[11]進行了高糖與腎小管上皮細胞TLR4表達關系的研究，結果發現高糖可刺激TLR4和IL-6、TNF-α等因子的表達，提示TLR4參與了DN的微炎癥反應。另一方面，通過查閱大量文獻報道還發現2型DN患者大多存在脂代謝異常，且隨著病情加重脂代謝亦明顯異常，由此產生大量的FFA，而FFA以白蛋白為載體形成白蛋白-脂肪酸復合物，其與高糖形成對腎小球的長期刺激，導致腎小球濾過膜通透性增高，進而濾過大量的白蛋白-脂肪酸復合物，這些復合物中的FFA被近曲小管重吸收后，便會對腎小管上皮細胞產生嚴重的破壞作用。早在2002年，Kamijo A等[12]就首先報道了結合FFA的白蛋白可加重腎小管間質的損傷。黃志文、梁東等[13，14]的一系列相關研究也表明，FFA通過誘導腎小管上皮細胞轉分化，促進其細胞外基質（ECM）的沉積并且抑制其降解引起腎小管損害。近幾年來，李媛、韓樂等[15，16]致力于研究FFA通過刺激死亡受體途徑誘導細胞的凋亡及刺激iNOS的表達來促進腎小管上皮細胞的凋亡，而關于FFA是否通過促進腎小管上皮細胞TLR4表達，進而激活NF-κB途徑，釋放一系列促炎因子，引起腎小管上皮細胞的損害這方面的研究，報道很少。因而，本研究通過使用不同濃度軟脂酸（游離脂肪酸的一種）干預腎小管上皮細胞，檢測TLR4 mRNA表達水平及IL-6、TNF-α的分泌情況，評價軟脂酸在導致腎小管上皮細胞受損的另一機制。結果顯示，12 h及24 h不同濃度軟脂酸組（125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L）與空白對照組及dBSA干預組相比，腎小管上皮細胞上TLR4表達均升高（P<0.05），而軟脂酸500 μmol/L組與軟脂酸（250 μmol/L、125 μmol/L）相比，差異亦有統計學意義（P<0.05），提示同一時間點，軟脂酸濃度越大，促進腎小管表達TLR4越多；對于同一濃度軟脂酸不同時間點（12 h、24 h）作用SD大鼠腎小管上皮細胞后，TLR4表達24 h比12 h明顯增高（P<0.05），可以推測軟脂酸作用腎小管上皮細胞時間越長，促使其表達TLR4可能越多。同時測定24 h點血清中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達，結果發現隨著PA濃度的增高二者表達也同樣增加（P<0.05），提示FFA可能是通過上調TLR4的表達，進而刺激IL-6、TNF-α等一系列炎癥因子的轉錄，從而引發或加重腎小管上皮細胞的炎癥反應，最終造成不同程度的損害。

綜上，DN高糖及高脂引起腎小球通透性增高，FFA結合載體后被濾過，作用于腎小管的上皮細胞，通過某種機制促進TLR4的表達，進而通過NF-κB途徑，促進IL-6、TNF-α等一系列炎癥因子的分泌，引起腎小管炎癥反應，造成其損害，最終加速了糖尿病腎病的發展。因此，本實驗可能為糖尿病腎病的發病機制提供新的思路，但是尚需進一步理論和實驗進行論證。

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（收稿日期：2013-12-31）

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（收稿日期：2013-12-31）