CD83＋成熟樹突細胞和CD11b＋耐受性樹突細胞在人頸動脈粥樣硬化病變中的分布

鄧瓊，胡何節，方征東，王曉天，孫小杰

（安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院血管外科，合肥 230001）

CD83＋成熟樹突細胞和CD11b＋耐受性樹突細胞在人頸動脈粥樣硬化病變中的分布

鄧瓊，胡何節，方征東，王曉天，孫小杰

（安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院血管外科，合肥 230001）

目的探討CD83＋成熟樹突細胞（mDC）和CD11b＋耐受性樹突細胞（tolDC）在人頸動脈粥樣硬化病變中的分布。方法收集頸動脈狹窄患者行頸動脈內膜剝脫術的頸動脈內膜標本20例，常規石蠟切片，HE染色，免疫組織化學染色觀察CD83和CD11b陽性反應血管樹突狀細胞的分布。結果CD83＋mDC和CD11b＋tolDC主要分布在頸動脈內膜斑塊、泡沫細胞以及新生血管周圍，成熟的CD83＋mDC細胞密度（8.34 ±1.20）個細胞／HPF較CD11b＋tolDC細胞密度（5.31±1.24）個細胞／HPF高。結論CD83＋mDC和CD11b＋tolDC在人頸動脈粥樣硬化動脈內膜均有分布，mDC的增多和tolDC的減少可能與人頸動脈粥樣硬化發生發展有關。

頸動脈狹窄；樹突細胞；細胞計數

頸動脈粥樣硬化（CAS）所致的頸動脈狹窄是目前威脅人類健康的主要疾病之一，研究認為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥免疫性疾病，炎癥和免疫是CAS發病的重要環節［1］。目前樹突細胞（DCs）是已知的體內功能最強大的專職抗原提呈細胞（APC），DC對自身抗原異常提呈，通過激活局部T淋巴細胞，來啟動由多種細胞參與的免疫炎性反應，從而在CAS病理演進中扮演著重要的角色［2-3］，mDC表達CD83［4］而tolDC表達CD11b［5］，目前國內外有關CAS的研究其對象多為動物模型，有關DCs的研究也多為mDC而對tolDC研究較少，本文以CAS患者的病變動脈內膜為研究對象，通過免疫組織化學技術對頸動脈內膜中的CDl1b和CD83分子進行檢測，探討mDC和tolDC在CAS病變中的分布。

圖1 CAS患者HE染色病理學改變（×400)

圖2 CD83和CD11b在CAS組中的表達(SP法，×400)

1 材料和方法

1.1 臨床標本 收集2011年10月至2013年5月安徽省立醫院血管外科頸動脈狹窄患者行頸動脈內膜剝脫術獲得的頸動脈內膜標本20例（經醫院倫理委員會同意并患者知情同意），標本均經10%甲醛固定。患者年齡48～72（64.2±10.7）歲，其中男性患者12例，女性患者8例，合并高血壓者14例，合并糖尿病者5例，根據以下標準確診：①臨床表現具有典型的臨床特征，②頸動脈彩色多普勒超聲或者頸動脈CTA，③組織病理學診斷。所有患者在就診2月內沒有使用免疫調節劑治療，亦未合并自身免疫性疾病和（或）惡性腫瘤。

1.2 主要試劑 兔抗人CD83單克抗體（LSC176864）購自LSBio公司，兔抗人CD11b單克抗體（ab1333571）購自Abcom公司，SP-9000免疫組織化學染色試劑盒，DAB酶底物顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫染色方法 用10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，制成5 mm厚的連續切片，所有標本各取兩張分別用CD11b抗體和CD83抗體進行免疫組織化學染色，用PBS代替一抗作陰性對照。免疫組織化學步驟如下：切片脫石蠟、水化、抗原修復，依次滴加過氧化物酶阻斷劑、封閉血清、一抗、生物素標記的二抗、鏈霉素抗生物素一過氧化物酶溶液，DAB顯色，復染，封片。

1.4 染色結果判斷標準［6］①樹突細胞計數：細胞計數采用OlympusBX40顯微鏡在×400下觀察。染色強度采用OlympusUPlanFL×40的物鏡觀察：顯示細胞質染色或膜染色的細胞都包括在陽性細胞計數中。每張免疫組織化學切片隨機取5個高倍視野進行CD11b或CD83陽性細胞計數，再分別取其平均數進行統計學分析，即每高倍視野的細胞數／HPF。②CD11b細胞判定標準：染色后的切片置光鏡下觀察，細胞質或細胞膜呈黃褐色，且具有不規則樹枝狀突起的細胞為CD11b＋細胞。③CD83細胞判定標準：以細胞膜或細胞質呈現黃褐色染色，且具有不規則樹枝狀突起的細胞為CD83＋細胞。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件分析，CD11b和CD83在CAS組織中表達的差異采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 HE染色結果 頸動脈內膜變性，局部管壁斑塊增厚，可見膽固醇結晶和鈣鹽沉積，少量淋巴細胞、泡沫細胞、紅細胞和多核巨細胞浸潤，外膜面纖維組織增生伴玻璃樣變性（圖1）。

2.2 免疫組織化學檢測結果 20例CAS病變組織中，耐受性樹突細胞由CD11b特征性標記，成熟樹突細胞由CD83特征性標記，成熟的CD83＋樹突細胞和耐受性的CD11b＋樹突狀細胞主要分布在內膜斑塊處以及泡沫細胞、新生滋養血管周圍（圖2），CD83表達明顯多于CD11b，CD83＋mDC細胞密度為（8.34±1.20）個細胞／HPF，CD11b＋tolDC密度為（5.31±1.24）個細胞／HPF，兩者相比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

本實驗所取標本均能肉眼可見AS斑塊，行HE染色可見頸動脈內膜變性，局部管壁增厚，伴有膽固醇結晶及鈣鹽的沉積，以及淋巴細胞等免疫細胞的浸潤，從病理分析：人頸動脈隨著年齡的增長而逐漸出現退行性改變，動脈內膜更易受到某些侵襲因素破壞導致內膜屏障功能減低，發生CAS的風險增加。此外我們通過免疫組織化學染色發現CD83＋mDC在頸動脈內膜大量分布，尤其豐富在不穩定斑塊、泡沫細胞以及新生滋養血管周圍，而CD11b＋tolDC少量分布于頸動脈內膜，主要分布在新生滋養血管周圍，并且CD83＋mDC細胞密度高于CD11b＋tolDC細胞密度［7-9］，Yilmaz等［10］研究發現在不穩定斑塊肩部區域有活性的DC與T細胞成簇分布，大量表達CD83等標志物，本實驗與Yilmaz等的研究結果相一致。本研究證實tolDC和mDC在頸動脈粥樣硬化內膜均有分布，tolDC細胞密度與mDC細胞密度比較，差異具有統計學意義，這說明tolDC細胞在AS病變頸動脈內膜的分布的減少和mDC在其分布的增多與CAS病變的發生發展密切相關，至于兩者在CAS病變中具體的參與機制有待進一步研究。

本研究證實CAS存在一定的免疫反應來抵御病變的進一步發展，國內外大量研究表明mDC不但參與了AS的發生發展，而且促進了AS的斑塊形成及發展成為不穩定性斑塊，tolDC能誘導調節性T細胞下調免疫反應，本研究發現tolDC在頸動脈內膜少量分布，這或許表明tolDC的缺乏不足以引起抑制炎癥的免疫反應來抵御AS的病變進展，為了抑制炎癥的進展，可以設想誘導tolDC形成而建立細胞免疫療法來治療CAS等AS疾病，實現免疫細胞多靶點多環節的調控，具有重要的理論意義和應用價值，但是需要進一步的研究來尋求有效的方法誘導和釋放tolDC而又不丟失它的免疫耐受功能。

（本文圖1，2見插圖1-1）

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The distribution of CD83＋mDC and CD11b＋tolDC in human carotid atherosclerotic lesions

DENGQiong，HU Hejie，FANGZhengdong，WANGXiangtian，SUN Xiaojie（Vascular Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001，China）

ObjectiveTo investigate the distribution of CD83＋mature dendritic cell（mDC）and CD11b＋tolerogenic dendritic cell（tolDC）in human carotid batherosclerotic lesions.Methods A total of 20 carotid intima specimens were collected as the object of from the carotid stenosis patients with carotid artery intima stripped.Paraffin sections were made and were stained with HE routinely.Immunohistochemical method was used to examine the distribution of CD11b and CD83 positive reaction dendritic cells（DC）.ResultsCD83＋mDC and CD11b＋tolDC were mainly distributed in the carotid artery intimal plaque，foam cells and around the new blood vessels.The average number mature CD83＋mDC per high power field（HPF）was 8.34±1.20 and significant decrease was observed in the density of tolerogenic CD11b＋tolDC 5.31±1.24 cells／HPF，P＜0.05.Conclusions CD83＋mDC and CD11b＋tolDC were all both distributed in human carotid artery atherosclerotic arterial intima，and the increased in the number of mDC and the decreased in the number of tolDC may be associated with the development of carotid atherosclerosis.

Carotid stenosis；Dendritic Cells；Cell Count

R543.4

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.01.015

2013-09-06）

安徽省自然科學基金項目（11040606M199）

鄧瓊，碩士在讀，Email：18356039711＠163.com

胡何節，教授，碩士生導師，Email：huhejie＠hotmail.com

Corresponding auther：HU Hejie，Email：huhejie＠hotmail.com