下調HER2磷酸化水平對骨肉瘤細胞U2-OS體外增殖轉移的抑制作用研究*

張志宏 龍新華 劉志禮 王 恒 汪逃芳 朱糧博

臨床研究

下調HER2磷酸化水平對骨肉瘤細胞U2-OS體外增殖轉移的抑制作用研究*

張志宏 龍新華 劉志禮△王 恒 汪逃芳 朱糧博

目的 探討下調人類表皮生長因子受體2（HER2）磷酸化水平對骨肉瘤細胞U2-OS體外增殖、侵襲轉移能力的影響。方法采用不同濃度（5、10、20、30、40 μmol/L）的HER2磷酸化抑制劑二甲苯磺酸拉帕替尼作用骨肉瘤細胞U2-OS。四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測作用不同時間（24、48、72 h）細胞的增殖能力，并計算出24 h藥物的半數抑制濃度（IC50）。10 μmol/L二甲苯磺酸拉帕替尼作用U2-OS細胞，Western blot檢測磷酸化HER2（p-HER2）蛋白表達水平；Wound healing和Transwell invasion實驗檢測細胞遷徙、侵襲能力。結果二甲苯磺酸拉帕替尼顯著抑制U2-OS細胞的增殖，并且呈時間、劑量依賴性；二甲苯磺酸拉帕替尼作用24 h后，細胞中p-HER2蛋白表達水平顯著低于陰性對照組（0.093±0.033 vs 0.306±0.033）；細胞遷徙率低于陰性對照組（%:32.70±3.00 vs 94.52±4.76），穿膜細胞數低于陰性對照組（個/視野：37±5 vs 85±10）。結論體外下調U2-OS細胞中HER2磷酸化水平能顯著抑制U2-OS細胞的增殖、遷徙和侵襲，HER2有望成為抗骨肉瘤侵襲轉移的分子靶點。

受體,表皮生長因子；氧化磷酸化；骨肉瘤；細胞增殖；腫瘤侵潤；二甲苯磺酸拉帕替尼；U2-OS

人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）已經被證實在乳腺癌中過度表達并促進癌細胞轉移，且其對化療藥物具有拮抗作用[1-3]。但HER2是否在骨肉瘤細胞中過度表達及其作用目前存在較大分歧[4-6]。最近又有研究認為HER2可能與骨肉瘤的浸潤及轉移有關[7]。本研究采用體外實驗研究抑制HER2磷酸化對骨肉瘤細胞U2-OS增殖及轉移的影響，為進一步探討HER2在骨肉瘤細胞中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞系購于美國Invitrogen公司，二甲苯磺酸拉帕替尼（GW-572016）購自美國Selleck公司，HAM’S/F-12培養基購自美國Hyclone公司，兔抗人磷酸化HER2（p-HER2）IgG、鼠抗人β-actin IgG購于SANTA CRUZ公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人骨肉瘤細胞U2-OS置于HAM’S/F-12培養基中（內含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 kU/L），在37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中貼壁培養。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細胞增殖能力 取對數生長期細胞進行實驗，常規消化貼壁細胞，調整細胞濃度為1×104/mL接種于無菌96孔培養板，每孔100 μL，常規培養12 h。待細胞貼壁良好，分別加入不同濃度的二甲苯磺酸拉帕替尼泊（5、10、20、30、40 μmol/L）作用24、48、72 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL。孵育4 h后，吸棄各孔培養液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL。微振蕩10 min，用酶標儀檢測波長490 nm處吸光度（OD）值，計算各組細胞生長抑制率=（對照組OD值-處理組OD值）/對照組OD值，計算24 h藥物的半數抑制濃度（IC50）。實驗重復3次。

1.2.3 Western blot檢測p-HER2表達水平 用終濃度10 μmol/L的二甲苯磺酸拉帕替尼（p-HER2抑制劑）作用人骨肉瘤細胞U2-OS 24 h后（PBS替代二甲苯磺酸拉帕替尼作為陰性對照）收集細胞，RIPA裂解，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（兔抗人p-HER2，1∶200，鼠抗人β-actin，1∶2 500）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，二抗（山羊抗兔和山羊抗鼠，1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，Pro-light HRP化學發光檢測試劑（TIANGEN，PA112）化學發光、壓片、拍照，用Image J軟件對條帶灰度值進行分析。重復實驗3次。

1.2.4 Wound healing檢測細胞遷徙能力 取對數生長期細胞進行實驗，常規消化細胞，調整細胞數5×105/mL，接種于6孔細胞培養板，待細胞成功形成單層貼壁細胞，用10 μmol/L的二甲苯磺酸拉帕替尼作用細胞（PBS替代二甲苯磺酸拉帕替尼為陰性對照組）24 h后，用10 μL槍頭在單層細胞表面劃一直線。用PBS漂洗2次去除劃落的細胞；加入含10 g/L BSA的無血清HAM’S/F-12培養液繼續培養24 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕中細胞遷移情況并拍照。Image J軟件測量遷徙距離，計算各組細胞遷徙率。不同時間重復實驗3次。

1.2.5 Transwell invasion檢測細胞侵襲能力 應用Transwell小室進行細胞遷移實驗。將用10 μmol/L的二甲苯磺酸拉帕替尼處理24 h后的細胞用含10 g/L的BSA無血清培養基重懸，調整細胞濃度為1×105個/mL，取150 μL細胞懸液接種小室，然后將小室放入加有600 μL/孔含10%胎牛血清的HAM’S/F-12培養基的24孔板中，常規培養24 h。取出小室，吸棄上室液體，用PBS漂洗2次，95%乙醇固定10 min，用棉簽擦凈小室膜上側未遷移的細胞，4 g/L結晶紫染色20 min，PBS漂洗2次。倒置顯微鏡下隨機讀取10個視野觀察細胞穿膜情況并拍照，Image J分析軟件計數（未經抑制劑處理細胞為陰性對照組）。不同時間重復實驗3次。

1.3 統計學方法 用SPSS 19.0進行統計學分析，數據以±s表示，采用獨立樣本t檢驗分析組間細胞遷徙與侵襲差異情況，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲苯磺酸拉帕替尼對U2-OS細胞增殖能力的影響 二甲苯磺酸拉帕替尼能有效抑制U2-OS細胞體外增殖，并呈時間、劑量依賴性，見圖1。根據本實驗結果計算24 h藥物IC50為22.15 μmol/L。

Figure 1 Inhibitory rates of different concentrations and durations of lapatinib ditosylate in U2-OS cell growth圖1 不同濃度二甲苯磺酸拉帕替尼作用不同時間對U2-OS細胞生長的抑制率

2.2 10 μmol/L二甲苯磺酸拉帕替尼對U2-OS細胞中p-HER2水平的影響 10 μmol/L二甲苯磺酸拉帕替尼處理U2-OS細胞24 h后，二甲苯磺酸拉帕替尼作用組細胞中p-HER2表達水平（0.093±0.033）顯著低于對照組（0.306±0.033），差異有統計學意義（t= 7.860，P＜0.05），見圖2。

Figure 2 Comparison of the p-HER2 expression level in U2-OS cells between two groups圖2 2組U2-OS細胞中p-HER2表達水平比較

2.3 下調HER2磷酸化水平對U2-OS細胞遷移、侵襲能力的影響 二甲苯磺酸拉帕替尼作用組細胞24 h體外遷徙率為（32.70±3.00）%，低于陰性對照組的（94.52±4.76）%，差異有統計學意義（t=19.051，P＜0.05）；二甲苯磺酸拉帕替尼作用組的穿膜細胞數為（37±5）個，低于陰性對照組的（85±10）個，差異有統計學意義（t=7.755，P＜0.05），見圖3。

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的原發性惡性骨腫瘤，惡性度高，遠處轉移出現早。雖然從20世紀70年代開始由于新輔助化療藥物的出現骨肉瘤患者的5年生存率提高到70%左右，但是，近30年來未見上升趨勢，并且合并肺部轉移患者5年生存率還是非常的不理想。因此通過研究原癌基因和抑癌基因來闡明骨肉瘤的發生、發展及轉移機制，進而尋找骨肉瘤治療的新的分子靶點，成為骨肉瘤防治研究的熱點。

Figure 3 The cell migration and invasion abilities detected by Wound healing(A)and Transwell invasion(B)assays圖3 Wound healing實驗（A）和Transwell invasion實驗（B）檢測2組U2-OS細胞遷徙、侵襲能力

原癌基因HER2屬于I型受體酪氨酸激酶（RTK）家族中的erbB亞家族。在正常情況下該基因處于非激活狀態，參與細胞分化的調節。當受到某些體內外因素刺激后，與erbB亞家族其他成員形成處于激活狀態的異二聚體，能使細胞內蛋白質的酪氨酸基磷酸化，產生細胞分裂信號，具有腫瘤轉化活性。研究表明，HER2在多條信號轉導通路中起作用，參與腫瘤的生長與分化[8]。HER2擴增或過表達可能通過其酪氨酸激酶活性使p34cdc2磷酸化，或（和）增強DNA修復酶的活性，能高效地進行DNA修復，阻止腫瘤細胞凋亡，并促進其生長[9-10]。

雖然有大量的研究證實HER2的過度表達與腫瘤的增殖、侵襲轉移有關[11-13]，但是對于HER2基因在骨肉瘤組織中是否有擴增情況及其作用如何，目前存在不同觀點[4-6]。最近研究表明骨肉瘤細胞存在EGFR、HER2/neu及Her-4固有磷酸化[14]。因此，根據HER2的生物學特性，筆者推測抑制HER2的磷酸化很有可能抑制骨肉瘤細胞的惡性表型。本研究結果顯示，體外下調骨肉瘤細胞U2-OS中HER2的磷酸化水平能有效的抑制細胞增殖、侵襲轉移，HER2及其相關信號通路有望成為抗骨肉瘤治療的分子靶點。但是，本研究僅采用一種細胞系進行體外研究，并且腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移與體內微環境的關系非常密切，所以還需要進一步的體內外實驗來探討HER2在骨肉瘤細胞增殖、侵襲轉移中的作用。

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（2013-07-16收稿 2013-09-04修回）

（本文編輯 閆娟）

The Inhibitory Effect of Down-Regulating Phosphorylated HER2 on Proliferation and Metastasis in U2-OS Osteosarcoma Cells

ZHANG Zhihong,LONG Xinhua,LIU Zhili,WANG Heng,WANG Taofang,ZHU Liangbo The First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo investigate the effects of down-regulating phosphorylated human epidermal growth factor receptor 2(HER2)on the proliferation and metastasis in human osteosarcoma cells(U2-OS)in vitro.MethodsVarious concentrations of HER2 phosphorylation inhibitor lapatinib ditosylate(5,10,20,30 and 40 μmol/L)were adopted to deal with U2-OS.MTT assay was performed to evaluate the cell proliferation during various times(24,48 and 72 h),and the IC50value in 24 h was calculated.The value of 10 μmol/L(IC50=22.15 μmol/L)was chosen to deal with U2-OS cells.The expression level of phosphorylated HER2(p-HER2)was measured by Western blot assay.The cell migration and invasion abilities were detected by Wound healing and Transwell invasion assays.ResultsThe cell proliferation of U2-OS was significantly inhibited by HER2 phosphorylation inhibitor lapatinib ditosylate in a concentration-and time-dependent manner.During 24 hours,the p-HER2 level was significantly lower in lapatinib ditosylate group than that of negative control group(0.093± 0.033 vs 0.306±0.033),the cell migration rate was significantly lower in lapatinib ditosylate group than that of negative control group(32.70%±3.00%and 94.52%±4.76%),and the trans-membrane cells were significantly lower than those of negative control group(37/HP±5/HP and 85/HP±10/HP),respectively.ConclusionThe down-regulating p-HER2 in U2-OS could efficiently inhibit the cell proliferation,migration and invasion in vitro.HER2 has the potential to become a molecular target for anti-osteosarcoma metastasis.

receptor,epidermal growth factor；oxidative phosphorylation；osteosarcoma；cell proliferation；neoplasm invasiveness；lapatinib ditosylate;U2-OS

R738.1

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.001

*國家自然科學基金資助（項目編號：81260400）；江西省自然科學基金資助（項目編號：20114BAB205093）

南昌大學第一附屬醫院骨科（郵編330006）

△通訊作者 E-mail:zgm7977@163.com