氟尿嘧啶植入劑對(duì)大腸癌患者外周血survivin、caspase-3、CD44V6的影響*

顏麗萍 管小倩 田小林 石曉萍 李 弘

大腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國大腸癌的發(fā)病率和病死率位居惡性腫瘤的第4位，且呈逐年上升趨勢[1]。目前，外科手術(shù)治療仍然是大腸癌的最主要治療方法。但是仍有一部分患者在接受了根治性手術(shù)后，出現(xiàn)了局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。根治術(shù)后患者5年生存率在50%左右，總體療效并未明顯改善。間質(zhì)化療可以將抗癌藥物制備成緩釋劑型局部植入，從而達(dá)到局部持久化療，降低大腸癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，還可避免全身不良反應(yīng)[2-3]。本研究旨在通過檢測氟尿嘧啶植入劑對(duì)大腸癌患者外周血survivin、caspase-3、CD44V6的影響，探討其抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年3月—2013年4月桂林市第二人民醫(yī)院和桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科收治的結(jié)直腸癌患者64例，男37例，女27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未行化療、未使用免疫抑制劑，無手術(shù)禁忌證可按常規(guī)行根治性手術(shù)。將64例患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對(duì)照組，每組32例。治療組在手術(shù)結(jié)束前根據(jù)腫瘤部位將氟尿嘧啶植入劑均勻植入瘤床、腫瘤病灶區(qū)域、對(duì)應(yīng)的腸系膜血管根部和相應(yīng)淋巴回流區(qū)域，表面噴灑生物蛋白膠固定，植入范圍距吻合口至少4 cm以上，總劑量為600 mg；對(duì)照組行根治術(shù)后不植入任何藥物。2組均按《NCCN腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南》的要求進(jìn)行術(shù)后靜脈化療。2組臨床資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Table 1 Comparison of clinical data between two groups表1 2組臨床資料比較 （n=32）

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備 所有患者均于術(shù)前1 d和術(shù)后14 d清晨空腹時(shí)靜脈采血2 mL，置于EDTA抗凝管，4℃冰箱保存。

1.2.2 主要試劑 RNApure超純總RNA快速提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒均購于北京艾德萊生物科技有限公司。引物均由invitrogen公司合成。CD44var（v6）（FITC）標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體購于eBioscience，陰性對(duì)照FITC Mouse IgG1,κ Isotype Ctrl購于BioLegend。檢測儀器采用美國BD公司生產(chǎn)的FACSAriaTMⅢ型流式細(xì)胞儀。氟尿嘧啶植入劑（散劑，商品名：中人氟安，蕪湖中人科技有限公司，批號(hào)20010826，規(guī)格100 mg/瓶）。

1.2.3 RT-PCR測定外周血survivin、caspase-3的表達(dá) 用紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞富集。利用RNApure超純總RNA快速提取試劑盒提取外周血總RNA，RT-PCR擴(kuò)增目的基因survivin、caspase-3和內(nèi)參基因β-ac?tin。引物序列：survivin 上游5＇-GTCCCTGGCTCCTCTACTG-3＇，下游5＇-GACGCTTCCTATCACTCTATTC-3＇，擴(kuò)增長度 174 bp；caspase-3 上游 5＇-AGAACTGGACTGTGGCATTGAG-3＇，下游 5＇-GCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-3＇，擴(kuò)增長度 191 bp；β-actin 上游5＇-AGAGCCTCGCCTTTGCCGAT-3＇，下游5＇-TGCCAGATTTTCTCCATGTCGT-3＇，擴(kuò)增長度 313 bp。sur?vivin、caspase-3及β-actin的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃3 min，變性94℃ 30 s，退火55.2℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30次循環(huán)，終延伸72℃5 min。Marker長度為600 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后，紫外燈下顯影拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定外周血CD44V6的表達(dá) 2個(gè)1.5 mL的EP管分別取100 μL抗凝血樣本，A管加入10 μL抗體，B管加入0.5 μL同型對(duì)照，室溫25℃避光孵育30 min。兩管分別加入已配好的900 μL溶血素（用去離子水稀釋為1∶100），室溫25℃避光孵育30 min。直至肉眼可見溶血透明。4℃ 2 000 r/min離心10 min。棄上清，500 μL PBS重懸洗滌2次。300 μL PBS將細(xì)胞重懸后，過濾上機(jī)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)比較用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，組間比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的兩樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血survivin和caspase-3的表達(dá)結(jié)果 術(shù)前2組survivin和caspase-3的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后治療組和對(duì)照組survivin的表達(dá)均明顯低于術(shù)前，且治療組survivin的表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05）；術(shù)后治療組和對(duì)照組caspase-3的表達(dá)均明顯高于術(shù)前，且治療組caspase-3的表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），見表2、圖1。

Table 2 The expressions of surviving and caspase-3 before and after surgery in two groups表2 各組手術(shù)前后survivin、caspase-3的表達(dá) （x±s）

2.2 外周血CD44V6的表達(dá)結(jié)果 術(shù)前2組CD44V6的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后治療組和對(duì)照組CD44V6的表達(dá)均明顯低于術(shù)前，且治療組CD44V6的表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05）,見表3、圖2。

Table 3 The expression of CD44V6 before and after surgery in two groups表3 各組手術(shù)前后CD44V6的表達(dá) （x±s）

Figure 2 The flow cytometry scatter plot of CD44V6 in two groups圖2 CD44V6的流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖

3 討論

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡發(fā)揮著重要作用。1997年Ambrosini等[4]首先分離出來了survivin基因，它是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的一種凋亡抑制因子，也是迄今為止唯一可通過內(nèi)源性抑制caspase活性而抑制細(xì)胞凋亡的因子。Shin等[5]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期的G2/M階段，主要是由survivin抑制凋亡來保證正常的細(xì)胞分裂。它與caspase-3一起定位于中心體的微管上，可直接作用于caspase-3和caspase-7，并抑制其活性，從而引起細(xì)胞凋亡。研究表明，survivin可通過抑制癌細(xì)胞凋亡促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及腫瘤新生血管生成而在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而通過以survivin為靶點(diǎn)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長，也可加強(qiáng)化療藥物的作用[6-7]。本研究表明，氟尿嘧啶植入劑可通過明顯抑制survivin的表達(dá)，上調(diào)caspase-3的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)其治療惡性腫瘤的作用。

CD44V6為目前比較公認(rèn)的腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因。它參與了3個(gè)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程：腫瘤細(xì)胞與血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與基膜之間、腫瘤細(xì)胞穿出基膜與器官組成細(xì)胞之間的黏附。較多研究報(bào)道，CD44V6的高表達(dá)是腫瘤高侵襲、易轉(zhuǎn)移的指標(biāo)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌中CD44V6的高表達(dá)賦予癌細(xì)胞較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，可以作為預(yù)測大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)有效指標(biāo)[10-11]。本研究結(jié)果顯示，2組術(shù)后14 d的CD44V6表達(dá)明顯低于術(shù)前，且治療組CD44V6的表達(dá)又低于對(duì)照組。筆者認(rèn)為，氟尿嘧啶植入劑能夠在給藥區(qū)域長時(shí)間穩(wěn)定維持較高的藥物濃度，殺死術(shù)中未切除的殘留病灶、微小轉(zhuǎn)移灶及腹腔游離癌細(xì)胞，術(shù)中給藥可明顯降低術(shù)后大腸癌患者的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，有助于改善其預(yù)后。

Figure 1 Electrophoresis of survivin and caspase-3 in two groups圖1 survivin和caspase-3的RT-PCR電泳圖

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