土槿乙酸對人肝癌細胞中血管內皮生長因子表達的影響

祝 平 郭蓮怡

土槿乙酸對人肝癌細胞中血管內皮生長因子表達的影響

祝 平 郭蓮怡△

目的探討土槿乙酸（PAB）對人肝癌細胞BEL-7402中血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法以0（對照組）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB處理人肝癌細胞BEL-7402，培養6 h，0.4%臺盼藍染色，在顯微鏡下觀察并計算細胞活率。采用WST-8法檢測細胞增殖，RT-PCR法檢測人肝癌細胞BEL-7402中VEGF mRNA表達，Western Blot檢測VEGF蛋白表達。結果不同劑量PAB處理的人肝癌細胞BEL-7402的細胞增殖率與對照組比較差異無統計學意義。隨著PAB濃度的增加，VEGF mRNA表達與對照組（2.53±0.07）相比分別降低至1.90±0.02、1.31± 0.03、0.86±0.04、0.60±0.03、0.34±0.02，差異有統計學意義（P＜0.01），VEGF蛋白表達與對照組（3.06±0.15）相比分別降低至2.60±0.09、2.42±0.07、1.85±0.05、0.92±0.05、0.60±0.04，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論PAB可抑制人肝癌細胞BEL-7402中VEGF mRNA和蛋白的表達。

細胞系,腫瘤；肝腫瘤；血管內皮生長因子類；逆轉錄聚合酶鏈反應；印跡法,蛋白質；土槿乙酸

原發性肝癌是常見的消化系統惡性腫瘤，全世界每年新發肝癌患者約60萬，而我國每年新患病人數約占世界新發肝癌人數的55%，居惡性腫瘤發病率第二位[1]。手術切除術作為肝癌首選治療方法，因其術后轉移、復發等特點，病死率仍然很高[2]。研究表明，血管的生成是腫瘤生長、轉移、侵襲的重要機制[3]。土槿乙酸（pseudolaric acid B,PAB）是土槿皮的主要活性成分之一，具有明確的抗生育、抗真菌、抗腫瘤及止血等作用。近年來，PAB的抗腫瘤作用越來越受到重視，其機制主要包括抑制細胞增殖、促進細胞凋亡及抑制腫瘤血管生成等。血管內皮生長因子（VEGF）是最有效和特異的誘導腫瘤血管內皮生成的因子，是多種抗腫瘤藥物的作用靶點。本研究探討PAB對肝癌細胞BEL-7402中VEGF mRNA及蛋白表達的影響，為進一步開發治療肝癌的新藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞BEL-7402購自江陰康眾康民生物醫藥技術有限公司。PAB購自上海彩佑實業有限公司，溶于少量二甲基亞砜（DMSO）中，加雙蒸水配制成400 μmol/L的水溶液，用培養液稀釋成所需濃度，DMSO終濃度小于0.1%。逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購自碧波公司，引物購自大連寶生物工程有限公司。兔抗人單克隆抗體、一抗VEGF及GAPDH單抗購自Enogene公司。CO2細胞培養箱（HERA Cell Heraeus），顯微鏡購自日本奧林巴斯，細胞圖像分析系統購自北京大恒圖像分析有限公司，DYC-31D電泳槽購自北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 人肝癌細胞BEL-7402中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，內含100 U/L青、鏈霉素，在37℃、5%CO2、正常氧濃度飽和濕度的培養箱中培養，常規胰蛋白酶消化法傳代細胞，傳到第3代，取對數生長期細胞用于實驗。細胞進入對數生長期后，將細胞按2×105/mL密度接種于6孔板，24 h細胞貼壁后，分別加入不同濃度的PAB，使其終濃度分別為0（對照組）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L，置37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養6 h，收集細胞。

1.2.2 細胞活力測定 將不同濃度的PAB作用于人肝癌細胞BEL-7402，用0.4%臺盼藍染色5 min，在顯微鏡下觀察死細胞染成藍色，計數染色細胞和總細胞數目，細胞活率為未染色細胞占總細胞的百分率。

1.2.3 WST-8法檢測細胞增殖 將人肝癌細胞BEL-7402按1×104/mL密度，每孔100 μL接種于96孔板，37℃、5%CO2孵育24 h，然后加入不同濃度PAB，培養箱中培養6 h后，每孔加入10 μL WST-8溶液，將培養板在培養箱中孵育2 h，酶標儀于450 nm波長下檢測各孔的光密度（OD）值。

1.2.4 RT-PCR法檢測VEGF mRNA表達水平 應用Primer Premier Version 5.0軟件設計引物。VEGF引物上游5′-GGGCTGCTGCAATGACGA-3′，下游5′-GTTTAACTCAAGC TGCCTCGC-3′，擴增長度360 bp；β-actin引物上游5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′，下游5′-GCATAGCACAGCCTGGATAG-3′，擴增長度250 bp。加入Trizol提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，OD260/OD280=1.6～1.8。取5 μg總RNA逆轉錄合成cDNA。2 μL cDNA用于PCR擴增。PCR反應：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，退火（VEGF 55℃，β-actin 52℃）30 s，72℃延伸1 min，30個循環，72℃最終延伸10 min，繼之1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，應用Fluorchem 2.01軟件進行分析，PCR產物VEGF條帶與內參條帶的OD值比值作為VEGF基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5 免疫印跡（Western Blot）法檢測VEGF蛋白表達水平 每孔細胞加入200 μL細胞裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，調整蛋白濃度為一致。制備10%SDS-page凝膠，每孔加入蛋白樣品20 μg電泳分離蛋白，轉印至PVDF膜后，5%脫脂奶粉TBS緩沖液封閉，加入兔抗人單克隆抗體，4℃過夜，洗膜30 min，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育，在新鮮配制的NBT/BCIP底物溶液中顯色20 min，流水沖洗終止顯色，照相。內參采用GAPDH。采用Fluorchem 2.01軟件分析蛋白條帶積分OD值（IDV）。以目的條帶與內參條帶的比值代表目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.3 統計學方法 用SPSS 17.0進行統計學處理，數據用均數±標準差（±s）表示，多組計量資料比較采用方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞活力測定 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB處理人肝癌細胞BEL-7402細胞活率均在95%以上。

2.2 細胞增殖分析 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB處理人肝癌細胞BEL-7402細胞增殖率分別為（97.25±0.41）%、（97.11±0.41）%、（96.89±0.49）%、（96.87±0.49）%、（96.79±0.69）%、（96.66±0.57）%，差異無統計學意義（F=1.078，P＞0.05）。

2.3 PAB對人肝癌細胞BEL-7402中VEGF mRNA表達的影響 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L PAB處理人肝癌細胞BEL-7402 6 h后，VEGF mRNA表達水平分別為2.53±0.07、1.90±0.02、1.31±0.03、0.86± 0.04、0.60±0.03、0.34±0.02，差異有統計學意義（F= 1 330.22，P＜0.01），各濃度組均低于對照組（均P＜0.01），呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1 Effects of PAB on the expression of VEGF mRNA in human hepatocellular carcinoma cells detected by RT-PCR圖1 RT-PCR檢測PAB對人肝癌細胞中VEGF mRNA表達的影響

2.4 PAB對人肝癌細胞BEL-7402 VEGF蛋白表達的影響 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/LPAB處理人肝癌細胞BEL-7402 6 h后，VEGF蛋白表達水平分別為3.06±0.15、2.60±0.09、2.42±0.07、1.85±0.05、0.92±0.05、0.60±0.04，差異有統計學意義（F=403.17，P＜0.01），各濃度組均低于對照組（均P＜0.01），呈劑量依賴性，見圖2。

Figure 2 Effects of PAB on the expression of VEGF protein in human hepatocellular carcinoma cells detected by Western Blot assay圖2 Western Blot檢測PAB對人肝癌細胞VEGF蛋白表達的影響

3 討論

VEGF是目前公認的最強的直接作用于血管內皮細胞的生長因子，是促進血管新生的主要因子之一[4]。成年人的肝臟血管非常豐富，由連續的內皮細胞圍繞而成的毛細血管結構所形成的血管生成作用在肝癌中最為典型[5]。新生血管雖然能夠為人體提供營養，排出腫瘤生長的代謝產物，但是，新生血管也是癌細胞擴散的重要途徑，同樣也是腫瘤生長、侵襲、轉移的一個重要步驟[6]。

有研究證實，VEGF表達于肝癌細胞和正常肝細胞中，隨著肝癌組織中血管生成作用的增強，VEGF的表達程度也逐漸增加，其表達水平大約是正常組織的7倍左右[7-8]。相關研究表明，肝癌組織中VEGF的表達與肝外轉移、組織分型、臨床分期、有無淋巴結等因素有關，在肝癌的發生發展及血管生成的過程中發揮著重要作用[9]。由此可見，通過抑制VEGF在肝癌中的表達來抑制腫瘤生長、血管新生及癌細胞轉移十分重要。

土槿皮也叫土荊皮，是松科植物金錢松的干燥根皮或近根樹皮。PAB是從土槿皮中分離出的20余種土槿酸之一，具有較強的細胞毒性作用[10]，傳統上主要用于抗真菌感染，后來發現其具有抗生育、抗腫瘤及抗血管生成作用。有研究發現，PAB可以減少大鼠動脈外源性血管芽并打破微血管的新形成[11]。因此，PAB具有抑制體內血管增殖的能力。在無細胞毒性作用時，PAB還可以促進VEGF刺激后的人臍靜脈內皮細胞凋亡，其作用機制是通過抑制VEGF誘導酪氨酸激酶受體即KDR/FLK 1磷酸化，從而阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，最終拮抗VEGF介導的抗凋亡效應[12]。

本研究結果顯示，不同劑量的PAB對肝癌細胞中VEGF mRNA及蛋白表達與對照組相比降低，并呈量效關系，目前，抑制血管內皮細胞的生長，成為治療腫瘤的重要途徑。VEGF能結合特定的受體，使內皮細胞增生，增加血管通透性，促進了血漿外滲的纖維蛋白，最終形成新的血管腔[13]。本研究結果表明，PAB可以通過抑制人肝癌細胞中VEGF的表達來抵抗肝癌血管的形成，通過阻斷腫瘤細胞的營養供給來抑制肝癌細胞的生長和轉移，具有明確的抑制血管生成作用。

綜上，PAB有明確的抗腫瘤、抗血管生成作用。作為中藥，具有來源廣泛、不良反應小、靶向作用強等優點，對其藥理機制的深入研究有助于研發高效能的新型抗腫瘤藥物。

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（2013-07-13收稿 2013-09-10修回）

（本文編輯 李國琪）

The Effect of Pseudolaric Acid on the Expression of VEGF in Hepatocellular Carcinoma Cells

ZHU Ping,GUO Lianyi
Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Liaoning 121001,China

ObjectiveTo investigate the effect of pseudolaric acid B(PAB)on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in human hepatoma BEL-7402 cells.MethodsBEL-7402 cells were cultured with PAB(0,0.5,1.0, 2.0,4.0 and 8.0 μmol·L-1)for 6 h and stained with 0.4%trypan blue.The cell viability was observed and calculated under the microscope.The cell proliferation was detected by WST-8 analysis.The expression of VEGF mRNA in BEL-7402 cells was detected using RT-PCR method.The expression of VEGF protein in BEL-7402 cells was detected using Western blot assay.ResultsThere was no significant difference in the cell proliferation of BEL-7402 cells between different PAB treatment groups and control group.With the increased concentration of PAB,the expressions of VEGF mRNA were significantly decreased in different PAB treatment groups(1.90±0.02,1.31±0.03,0.86±0.04,0.60±0.03 and 0.34±0.02)compared with that of control group(2.53±0.07,P＜0.01).The expressions of VEGF protein were significantly decreased in different PAB treatment groups(2.60±0.09,2.42±0.07,1.85±0.05,0.92±0.05 and 0.60±0.04)compared with that of control group(3.06±0.15, P＜0.01).ConclusionPAB can inhibit the expressions of VEGF mRNA and protein in BEL-7402 cells.

cell line,tumor;liver neoplasms;vascular endothelial growth factors;reverse transcriptase polymerase chain reaction;blotting,western;pseudolaric acid B

R735.7

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.004

遼寧醫學院附屬第一醫院消化內科（郵編121001）

△通訊作者 E-mail:angel_gly@163.com