MMP-9和Ki67在胰腺癌中表達的意義

孫 宇 孫 寧 楊紹時 宋國棟 陳劍秋

MMP-9和Ki67在胰腺癌中表達的意義

孫 宇 孫 寧 楊紹時 宋國棟 陳劍秋

目的 探討胰腺癌中基質金屬蛋白酶（MMP）-9與Ki67表達的相關性及其臨床意義。方法采用S-P免疫組化染色技術，檢測100例胰腺癌中MMP-9及Ki67的表達情況，分析其表達水平與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、分化程度及術后生存時間的相關性。結果100例胰腺癌中，MMP-9高表達46例（46%），Ki67高表達53例（53%），且淋巴結有轉移、TNM分期級別高、病理分化程度低患者的MMP-9和Ki67的表達高于無淋巴結轉移、TNM分期級別低和病理分化程度高的患者（P＜0.05），不同年齡、腫瘤直徑間MMP-9和Ki67的表達差異無統計學意義。MMP-9與Ki67表達呈正相關（rs=0.405，P＜0.05）。生存結局與年齡、淋巴結轉移、病理分化程度、MMP-9表達相關，與腫瘤大小、局部浸潤及Ki67表達無關。結論MMP-9與Ki67表達在胰腺癌的侵襲中起協同作用。MMP-9表達對于判斷預后和指導治療具有一定的臨床價值。

胰腺腫瘤；基質金屬蛋白酶9；Ki-67抗原；免疫組織化學；預后

胰腺癌發病隱匿，病情發展迅速，病死率高。腫瘤微環境中富含膠原的纖維反應可能與胰腺癌的侵襲、轉移相關[1]。基質金屬蛋白酶（MMP）-9屬于基質金屬蛋白酶家族（MMPs），能夠降解腫瘤微環境中的多種蛋白膠原，促進腫瘤侵襲[2]。Ki67是一種與增生相關的標志物，在細胞周期的G1、S和G2期達到高峰，而在G0期缺失，在許多腫瘤中高表達[3]。本研究采用免疫組化S-P法檢測了100例胰腺癌中MMP-9及Ki67的表達，旨在探討其在胰腺癌中的相關性及臨床意義。

l資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年1月—2007年12月我院收治的胰腺癌患者127例。除外類癌6例，失訪20例，非胰腺癌死亡1例，共有臨床病理資料完整的胰腺導管腺癌100例，均接受手術治療，術前未接受放化療。其中男68例，女32例，年齡40～82歲，中位年齡58.66歲。均接受術后化療。按胰腺癌的國際臨床分期標準（AJCC，2010），分為Ⅰ期44例，Ⅱa期24例，Ⅱb期32例。根據WHO標準分型，均為胰腺腺癌；其中伴淋巴結轉移者32例，不伴淋巴結轉移者68例；高分化癌12例，中分化癌52例，低分化癌36例。

1.2 免疫組化檢測方法 所有標本均經福爾馬林固定，石蠟包埋，常規切片，片厚4 μm，采用免疫組化S-P法染色，DAB顯色，鼠抗人MMP-9、Ki67單克隆抗體，DAB顯色試劑及免疫組化S-P法試劑盒，均購自北京中杉生物技術有限公司。采用ABC法，用DAB顯色，經蘇木精復染，常規光鏡觀察。結果判定采用半定量積分法，即根據每張切片的陽性細胞比例及著色深淺記分。用PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照為已知的胰腺癌陽性片。腫瘤組織染色判定標準：（1）根據陽性細胞百分比分為5級：0分，無染色；1分，染色細胞1%～24%；2分，25%～49%；3分，50%～74%；4分，≥75%。（2）根據染色強度分為4級：0分不著色；1分淺黃色；2分棕黃色；3分深棕色。每份切片記分=染色細胞數分數+染色強度分數。所得分數＜5分為低表達，≥5分為高表達。

1.3 隨訪 對本組100例胰腺癌患者均進行了隨訪。局部復發通過腫塊局部切除送病理檢查證實，遠處轉移通過體檢、X線、B超及CT等證實。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。計數資料行χ2檢驗、Fisher確切概率檢驗。各指標間表達強度的相關關系采用Spearman等級相關分析，生存時間影響因素分析采用COX回歸，不同表達水平的生存時間比較用Kaplan-Meier法。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 胰腺癌原發灶MMP-9及Ki67的表達情況 Ki67定位于細胞核，見圖1，MMP-9定位于細胞漿，見圖2。100例胰腺癌中，MMP-9高表達46例，Ki67高表達53例，且淋巴結有轉移、TNM分期級別高、病理分化程度低患者的MMP-9和Ki67的表達高于無淋巴結轉移、TNM分期級別低和病理分化程度高的患者（P＜0.05），不同年齡、腫瘤大小間MMP-9和Ki67的表達差異無統計學意義，見表1。

Figure 1 The expression of Ki67 in pancreatic cancer cells (immunohistochemistry,×200)圖1 Ki67在胰腺癌細胞內表達（免疫組化染色,×200）

Figure 2 The expression of MMP-9 in pancreatic cancer cells (immunohistochemistry，×200)圖2 MMP-9在胰腺癌細胞內表達（免疫組化染色，×200）

Table 1 The high expressions of MMP-9 and Ki67 in pancreatic cancer表1 胰腺癌原發灶MMP-9及Ki67的高表達情況例（%）

2.2 胰腺癌原發灶MMP-9與Ki67表達的相關性 Ki67高表達的53例中MMP-9高表達38例，低表達15例。Ki67低表達的47例中MMP-9高表達8例，低表達39例，MMP-9與Ki67表達呈正相關（rs= 0.405，P＜0.05）。

2.3 MMP-9及Ki67表達與胰腺癌患者術后結局的關系 COX回歸協變量分別為淋巴結轉移（有=1，無= 0）、腫瘤大小（≥2 cm=1，＜2 cm=0）、局部浸潤（有=1，無=0）、MMP-9及Ki67（高低表達分別賦值1、0）、病理分化程度（低、中、高分別賦值0、1、2）和年齡，結果顯示術后不良結局與年齡、淋巴結轉移、病理分化程度、MMP-9表達相關，與腫瘤大小、局部浸潤以及Ki67表達無關，見表2。MMP-9高表達患者的生存時間低于低表達患者（χ2=30.506，P＜0.01），見圖3。

Table 2 The COX analysis of overall survival after the surgery of pancreatic cancer表2 胰腺癌術后生存時間的COX分析

Figure 3 Comparison of overall survival after the surgery between two groups with different expression levels of MMP9圖3 MMP-9兩個表達水平的術后生存率比較

3 討論

胰腺癌在生物學行為上具有高度侵襲性，早期即可出現周圍血管、神經以及淋巴結的浸潤轉移，甚至遠處轉移。其中胰腺癌腫瘤細胞的高侵襲性可能與MMP-9對細胞外基質的降解相關[4]。本研究通過免疫組化的方法證實了MMP-9及Ki67在胰腺癌細胞中呈高表達，其中46%的胰腺癌細胞中高表達MMP-9，53%的胰腺癌細胞中高表達Ki67，并且這兩種蛋白的表達呈正相關。MMP-9及Ki67的表達強度與胰腺癌TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤分化程度相關。

MMPs是一組鋅離子依賴性的內肽酶，屬于蛋白水解酶的一種，幾乎能降解細胞外基質的所有成分。近年來的實驗研究發現MMP在惡性腫瘤的侵襲及轉移中發揮著重要作用。目前，MMPs家族由11個成員組成。根據其結構和底物特異性將其劃分成4組：膠原酶、白明膠酶、基質降解酶及其他。MMP-9又稱為明膠酶B，是MMPs中分子質量最大的酶。以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，降解、破壞靠近腫瘤表面的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠，然后腫瘤細胞沿著缺失的基底膜向周圍浸潤，最終導致腫瘤的侵襲和轉移。另一方面則通過毛細血管內生、新生血管生成等促進腫瘤浸潤和轉移[5]。已有證據表明，MMP-9在胰腺癌中高表達，且與腫瘤淋巴轉移相關，本實驗結果與其基本一致[6-7]。因此，MMP-9在胰腺癌細胞浸潤、轉移中起重要作用。

Ki67是一種細胞核非組蛋白，其普遍表達于增生期細胞而在靜止細胞中缺失，因此Ki67可作為細胞增生的一種生物標志。Ki67對細胞分裂的確切功能還不十分清楚，但是其在有絲分裂的G1、S、G2期達到高峰，而在G0期缺失[3]。Laird等[8]的研究表明Ki67在腎癌中的表達明顯低于其肝轉移灶中的表達，說明Ki67與腫瘤的轉移相關。

關于MMP-9和Ki67與胰腺癌預后的關系，觀點尚未統一。本研究結果顯示，預后結局與年齡、淋巴結轉移、病理分化程度、MMP-9表達相關，與腫瘤大小、局部浸潤及Ki67表達無關，提示MMP-9的表達可作為判斷胰腺癌患者預后的參考指標之一，而Ki67并不能獨立影響胰腺癌術后生存時間，因此MMP-9高表達的胰腺癌患者術后需要更密切的觀察及綜合輔助治療。

[1]Dangi-Garimella S,Sahai V,Ebine K,et al.Three-dimensional collagen i promotes gemcitabine resistance in vitro in pancreatic cancer cells through hmga2-dependent histone acetyltransferase expression[J].PLoS One,2013,8(5):e64566.

[2]Zhang C,Li C,Zhu M,et al.Meta-analysis of mmp2,mmp3,and mmp9 promoter polymorphisms and head and neck cancer risk[J]. PLoS One,2013,8(4):e62023.

[3]Weigel MT,Dowsett M.Current and emerging biomarkers in breast cancer:Prognosis and prediction[J].Endocr Relat Cancer,2010,17 (4):R245-262.

[4]郭仁德,王偉忠,顧建華,等.胰腺癌細胞中GDNF對MMP-9表達的影響[J].天津醫藥,2013,41(1):1-4.

[5]Kuhlmann KF,van Till JW,Boermeester MA,et al.Evaluation of matrix metalloproteinase 7 in plasma and pancreatic juice as a biomarker for pancreatic cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(5):886-891.

[6]Giannopoulos G,Pavlakis K,Parasi A,et al.The expression of matrix metalloproteinases-2 and-9 and their tissue inhibitor 2 in pancreatic ductal and ampullary carcinoma and their relation to angiogenesis and clinicopathological parameters[J].Anticancer Res, 2008,28(3B):1875-1881.

[7]Pryczynicz A,Guzinska-Ustymowicz K,Dymicka-Piekarska V,et al.Expression of matrix metalloproteinase 9 in pancreatic ductal carcinoma is associated with tumor metastasis formation[J].Folia Histochem Cytobiol,2007,45(1):37-40.

[8]Laird A,O'Mahony FC,Nanda J,et al.Differential expression of prognostic proteomic markers in primary tumour,venous tumour thrombus and metastatic renal cell cancer tissue and correlation with patient outcome[J].PLoS One,2013,8(4):e60483.

（2013-07-05收稿 2013-09-20修回）

（本文編輯 魏杰）

The Differential Expression of MMP-9 and Ki67 in Pancreatic Cancer

SUN Yu,SUN Ning,YANG Shaoshi,SONG Guodong,CHEN Jianqiu
Department of Surgery,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective To investigate the expression and significance of MMP-9 and Ki67 for predicting the progression and prognosis of pancreatic cancer.MethodsS-P immunohistochemical method was used to detect the expressions of MMP-9 and Ki67 in 100 pancreatic cancer tissue specimens.The relationship between the expressions of MMP-9 and Ki67 and patient age,tumor size,lymph node metastasis,tumor differentiation,clinical stages and prognosis were analyzed.ResultsThere were higher expressions of MMP-9 protein 46%(46/100)and Ki67 protein 53%(53/100)in 100 samples of pancreatic adenocarcinoma.And the expressions of MMP-9 and Ki67 were inversely associated with tumor differentiation, clinical stages,and lymph node metastasis of pancreatic cancer(P＜0.05).There were no significant differences in the expressions of MMP-9 and Ki67 between patient age and tumor size.The expressions of MMP-9 and Ki67 were positive correlated(rs=0.405，P＜0.05).Moreover,the overall survival rates were correlated with patient age,lymph node metastasis,tumor differentiation and the expression of MMP-9,but no correlation with tumor size,clinical stages,and the expression of Ki67.ConclusionThe expressions of MMP-9 and Ki67 were associated with pancreatic cancer progression.And the detection of expression of MMP-9 may have practical value in prognosis in patients with pancreatic cancer．

pancreatic cancer;MMP-9;Ki67;immunohistochemistry;prognosis

R735.9

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.014

天津醫科大學第二醫院外科（郵編300211）