N-乙酰半胱氨酸對輻射致小鼠骨髓單個核細胞損傷的保護作用*

張俊伶 路 璐 李德冠 吳紅英 孟愛民

N-乙酰半胱氨酸對輻射致小鼠骨髓單個核細胞損傷的保護作用*

張俊伶 路 璐 李德冠 吳紅英 孟愛民△

目的觀察抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）對輻射致小鼠骨髓單個核細胞（BMMNCs）損傷的保護作用，進一步探討其可能的作用機制。方法實驗分為對照組、輻射組（輻射劑量1、4 Gy）、輻射加NAC組（輻射1、4 Gy前30 min各組加入NAC）。按分組不同將2×106/mL濃度細胞懸液與RPMI-1640培養基和2×10-5mol/L NAC溶液加入2 mL無菌EP管內，37℃CO2孵箱內孵育30 min后γ射線分別輻射1、4 Gy。生物發光法檢測小鼠BMMNCs細胞活力、活性氧檢測探針（DCFH-DA）檢測細胞內活性氧（ROS）水平、集落形成數目檢測克隆形成能力。結果輻射暴露4 Gy后，輻射組小鼠BMMNCs細胞活力（發光值：284 296.7±16 541.2），明顯低于對照組的（848 586.7±61 404.4）；輻射暴露1 Gy后，輻射組細胞內ROS水平（熒光值：6 750.0±103.5）高于對照組的（5 710.7±56.2），小鼠BMMNCs克隆形成能力輻射組為（626.7±51.3）克隆數/105細胞，低于對照組的（986.7±100.7）克隆數/105細胞；而輻射加NAC組，與輻射組比較小鼠BMMNCs細胞活力增加至發光值352 770.0±23 466.1、細胞內ROS水平下降至熒光值5 430.0±61.0、BMMNCs克隆形成能力增加至（773.3±49.3）克隆數/105細胞。結論NAC對輻射暴露小鼠BMMNCs損傷可能是通過降低細胞內ROS水平達到保護作用。NAC可以作為后續實驗研究的陽性對照藥。

乙酰半胱氨酸；單核細胞；骨髓；輻射損傷；輻射劑量；輻射防護；小鼠，近交C57BL/6

近年研究顯示，輻射可以誘導細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高[1]。正常情況下，造血干細胞（hematopoietic stem cell,HSC）定位于骨髓的低氧環境中，低氧環境對于維持HSC自我更新與定向分化具有重要作用[2]。輻射暴露后HSC內ROS水平升高，HSC損傷嚴重。N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-cysteine，NAC）是一種抗氧化劑，具有干擾自由基生成，清除已生成的自由基等作用。此外NAC還是谷胱甘肽的前體，在體內可以轉化為谷胱甘肽發揮對組織的保護作用。本研究根據NAC對自由基的干擾及清除作用，觀察其對輻射暴露骨髓單個核細胞（BMMNCs）損傷的保護作用，進一步探討其可能的保護機制，為本實驗室后續實驗研究輻射損傷機制提供陽性對照藥物。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 NAC、ROS檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Celltiter-Glo,Promega；甲基纖維素半固體培養基（Methylcellulose Medium for Mouse cells,M3534，Stem Cell Technologies）。多功能酶標儀，TECAN，InfiniteM200。137Csγ射線輻射源，加拿大原子能有限公司，型號USD，Autocell40。

1.2 實驗動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠15只，18～25 g，購自維通利華，飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心。

1.3 方法

1.3.1 小鼠BMMNCs分離 無菌分離小鼠雙側股骨脛骨，去除表面附著肌肉，用2.5 mL一次性無菌注射器在Hank’s液中將骨髓細胞沖出。將沖出的細胞懸液加入50 mL EP管內，按照細胞懸液與Ficoll 2∶1比例用腰穿針在細胞懸液底部緩慢加入Ficoll，分離時將離心機升速與降速均調至最低[3]。離心完畢取中間絮狀層加入至另一50 mL EP管內，Hank’s液離心洗滌細胞2次，最后用RPMI-1640（加10%胎牛血清）培養基將細胞濃度調為2×106/mL使用。

1.3.2 NAC毒性檢測 Hank’s液溶解NAC粉末，使用帶有0.22 μm濾膜的小濾器過濾除菌。用RPMI-1640（加10%胎牛血清）培養基依次10倍稀釋NAC溶液，濃度分別為2×10-2、2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6mol/L。將2×106/mL濃度的BMMNCs接種至96孔板內，每孔100 μL，對照組加入100 μL RPMI-1640（加10%胎牛血清），其余各組加入相應不同濃度NAC溶液，每孔100 μL，因此NAC終濃度分別為1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mol/L。每組設置6個平行孔。培養18 h后用多功能酶標儀檢測細胞活力。

1.3.3 實驗分組 實驗分為3組。對照組：取2×106/mL濃度的BMMNCs懸液700 μL加入至2 mL EP管內，再加入RPMI-1640（加10%胎牛血清）700 μL吹打混勻。輻射組：在對照組基礎上進行放射線輻射。輻射加NAC組：將700 μL濃度為2×106/mL的BMMNCs懸液加入至2 mL EP管內，再加入2×10-5mol/L NAC溶液700 μL吹打混勻，與對照組、輻射組細胞同時在37℃CO2孵箱內孵育30 min后，輻射組和輻射加NAC組γ射線輻射，輻射劑量1、4 Gy。

1.3.4 小鼠BMMNCs損傷檢測 輻射完畢后接種于96孔板內，每孔200 μL。每組設置6個平行孔。培養18 h后用多功能酶標儀檢測細胞活力。

1.3.5 小鼠BMMNCs內ROS水平檢測 輻射完畢后接種于24孔板內，37℃CO2孵箱內培養18 h后將各組細胞取出加入至2 mL EP管內。各管按照細胞懸液與活性氧檢測探針（DCFH-DA）1 000∶1的比例加入DCFH-DA，37℃CO2孵箱內孵育30 min后離心，棄去上清后用無血清RPMI-1640培養基洗滌3次以洗去探針，最后用無血清RPMI-1640培養基將細胞懸起，接種至96孔黑板內，每組設置6個平行孔。多功能酶標儀檢測細胞熒光值。吸收光488 nm，發射光522 nm[4]。

1.3.6 小鼠BMMNCs克隆形成能力檢測 1、4 Gy接種細胞濃度分別為1×104/mL、2×104/mL和1×105/mL。加0.2 mL稀釋好的細胞懸液至2 mL甲基纖維素半固體培養基內振蕩器充分混勻，靜置2～5 min，待氣泡消失。用2.5 mL注射器連接16號平頭注射器針頭，吸取0.5 mL細胞混懸液，加入24孔板，輕搖培養板，使培養基均勻分布。每組設置6個平行孔。將培養板置入37℃，5%CO2培養箱中培養，第5天低倍觀察集落形成情況，細胞數≥30為陽性集落。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0對數據進行處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間的均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NAC對小鼠BMMNCs毒性作用范圍 1×10-6mol/L和1×10-5mol/L濃度NAC能夠促進BMMNCs增殖，在此濃度范圍內，隨NAC濃度增加細胞活力增加，1×10-5mol/L濃度NAC促進細胞增殖能力最強。1×10-4mol/L和1×10-3mol/L濃度NAC處理后，細胞活力為對照組細胞活力的97%和94%，1×10-2mol/L濃度NAC對BMMNCs有明顯毒性作用，BMMNCs幾乎全部死亡，見圖1。

Figure 1 Toxic effects of NAC on BMMNCs圖1NAC對小鼠BMMNCs毒性作用檢測（n=6±s）

2.2 NAC對輻射暴露小鼠BMMNCs細胞活力的影響 毒性實驗結果顯示1×10-5mol/L濃度NAC能夠促進BMMNCs增殖，因此以下實驗NAC濃度均選用1×10-5mol/L。與對照組比較，輻射組1 Gy及4 Gy輻射暴露后細胞活力下降，而輻射加NAC組1 Gy和4 Gy輻射暴露的BMMNCs細胞活力明顯增加，見表1。

Table 1 NAC improved the irradiation-induced decrease of BMMNCs viability表1NAC改善輻射引起的小鼠BMMNCs活力下降（n=6，發光值，±s）

Table 1 NAC improved the irradiation-induced decrease of BMMNCs viability表1NAC改善輻射引起的小鼠BMMNCs活力下降（n=6，發光值，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與輻射組比較,P＜0.05；表2、3同

組別對照組輻射組輻射加NAC組F 1 Gy 831 463.3±20 515.9 460 253.3±34 586.0a528 250.0±27 767.7ab394.34＊＊4 Gy 848 586.7±61 404.4 284 296.7±16 541.2a352 770.0±23 466.1ab371.47＊＊

2.3 NAC對輻射暴露小鼠BMMNCs內ROS水平的影響 輻射組輻射暴露1 Gy、4 Gy后BMMNCs內ROS水平明顯高于對照組和輻射加NAC組，見表2。

Table 2 NAC reduced the irradiation-induced increase of ROS level in BMMNCs表2NAC降低輻射引起的BMMNCs內ROS的變化 （n=6，熒光值±s）

Table 2 NAC reduced the irradiation-induced increase of ROS level in BMMNCs表2NAC降低輻射引起的BMMNCs內ROS的變化 （n=6，熒光值±s）

組別對照組輻射組輻射加NAC組F 1 Gy 5 710.7±56.2 6 750.0±103.5a5 430.0±61.0ab495.09＊＊4 Gy 5 552.7±109.4 7 266.3±85.7a6 140.0±31.0ab673.25＊＊

2.4 NAC對輻射暴露小鼠BMMNCs克隆形成能力的影響 輻射組輻射暴露1 Gy和4 Gy后BMMNCs克隆形成能力較對照組明顯下降，而輻射加NAC組1 Gy輻射暴露的克隆形成能力較輻射組增加，見表3。

Table 3 Comparison of the ability of BMMNC colony-forming units improved by NAC in irradiation model mice表3NAC改善輻射引起的小鼠BMMNCs克隆形成能力比較 （n=6，克隆數/105細胞±s）

Table 3 Comparison of the ability of BMMNC colony-forming units improved by NAC in irradiation model mice表3NAC改善輻射引起的小鼠BMMNCs克隆形成能力比較 （n=6，克隆數/105細胞±s）

組別對照組輻射組輻射加NAC組F 1 Gy 986.7±100.7 626.7±51.3a773.3±49.3ab38.50＊＊4 Gy 1 026.7±94.5 44.4±1.1a57.1±4.8a628.71＊＊

3 討論

HSC是造血組織中一類特殊的細胞，在進行自我更新的同時定向分化為各類造血祖細胞，進一步分化為血液系統中各類成熟細胞。骨髓是輻射敏感組織，電離輻射可以誘導HSC損傷，引起急性骨髓抑制和持久性骨髓損傷。對小鼠進行全身輻射能夠引起HSC內ROS升高，因此有效的抗氧化劑能夠減輕輻射引起的HSC損傷[5-7]。本研究觀察抗氧化劑NAC對骨髓輻射損傷的體外保護作用，由于HSC大部分存在于BMMNCs群內，故實驗選取骨髓單個核細胞作為研究對象。實驗結果顯示，NAC對BMMNCs毒性作用較小，在濃度為1×10-6～1×10-3mol/L濃度范圍內細胞活力變化不大，僅在濃度為1×10-2mol/L時具有明顯的細胞毒性作用。輻射暴露1 Gy、4 Gy前加入NAC孵育30 min后，與輻射組比較，細胞活力明顯增加，說明NAC對輻射暴露小鼠BMMNCs損傷具有保護作用。觀察到這一作用后，本研究繼續探討保護作用的可能機制，即對細胞內ROS水平的影響結果顯示，使用NAC后細胞內ROS水平顯著下降，說明NAC能夠有效降低細胞內ROS水平，與之前體內研究結果一致[1]。克隆形成實驗是功能實驗，檢測骨髓造血祖細胞自我更新功能，本研究觀察到，應用NAC后1 Gy輻射暴露組BMMNCs克隆形成能力顯著增加，說明NAC能夠顯著改善輻射暴露后造血祖細胞自我更新功能。

總之，NAC對輻射暴露引起的BMMNCs損傷有較好的保護作用，其最直接的作用為降低細胞內ROS水平。ROS激活的信號通路及更加有效的清除ROS藥物的開發將會成為日后研究的重點及熱點。而在輻射防護藥物的篩選過程中，與體內實驗相比，體外實驗需要藥物量較少，實驗過程較快，能夠為體內藥效學研究提供指導。

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[3]Meng A,Wang Y,Van Zant G,et al.Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells[J].Cancer Res，2003,63(17):5414-5419.

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（2013-06-03收稿 2013-09-02修回）

（本文編輯 魏杰）

Protective Effects of N-Acetyl-Cysteine on Irradiation-Induced Bone Marrow Mononuclear Cell Injury

ZHANG Junling,LU Lu,LI Deguan,WU Hongying,MENG Aimin
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,the Key Laboratory of Radiation and Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo observe the protective effect of N-acetyl-cysteine(NAC)on the injury of irradiation-induced bone marrow mononuclear cells(BMMNCs),and explore the possible mechanism.MethodsThere were 3 groups in the study:control group,irradiation group(doses of irradiation were 1 Gy and 4 Gy)and irradiation with NAC group(NAC was cocultured with BMMNCs half hour before irradiation).The 2×106/mL BMMNCs and the RPMI-1640 medium or 2×10-5mol/L NAC were added into the 2 mL EP tubes according to the different requirement of groups.The tubes were then cultured in the 37℃CO2incubator for 30 min and irradiated with 1 Gy and 4 Gy.The viability of BMMNCs was measured by bioluminescence.The level of reactive oxygen species(ROS)was measured by DCFH-DA,and the ability of colony-forming units was detected by CFU-GM.ResultsAfter 4 Gy irradiation exposure,the cell viability of BMMNCs was significantly lower in irradiation group(284 296.7±16 541.2)than that of control group(848 586.7±61 404.4).After 1 Gy irradiation exposure,the level of ROS was higher in irradiation group(6 750.0±103.5)than that of control group(5 710.7±56.2).The number of colony-forming units per 105cells after irradiation exposure was(626.7±51.3),which was significantly lower than that of control group(986.7±100.7).Compared to irradiation group,the cell viability of BMMNCs increased to(352 770.0±23 466.1) in irradiation with NAC group.The level of ROS decreased to(5 430.0±61.0),and the number of colony-forming units per 105cells increased to(773.3±49.3).ConclusionNAC has protective effect on irradiation-induced injury in BMMNCs，which may be related with the decreased level of ROS.NAC can play the role of positive control for the following work.

acetylcysteine;monocytes;bone marrow;radiation injuries;radiation dosage;radiation protection;mice, inbred C57BL/6

R551

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.017

*國家973重大專項資助項目（項目編號：2011CB964800-G）；國家自然科學基金資助項目（項目編號：81072237，81129020）；天津市重點基金資助項目（項目編號：11JCZDJC19100）；教育部高等學校博士學科點專項基金（項目編號：20111106110038）；中國醫學科學院放射醫學研究所發展基金（項目編號：1309）

中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與核醫學重點實驗室（郵編300192)

△通訊作者 E-mail：ai_min_meng@126.com