降鈣素和1,25維生素D拮抗牙周炎大鼠牙槽骨喪失的療效觀察

許崇游 馬艷華 盛君曼 殷 愷

降鈣素和1,25維生素D拮抗牙周炎大鼠牙槽骨喪失的療效觀察

許崇游 馬艷華 盛君曼 殷 愷△

目的探討降鈣素與1,25維生素D對牙周炎導致大鼠牙槽骨喪失的影響。方法雄性Wistar大鼠125只隨機分為空白對照組（A組）、牙周炎對照組（B組）、降鈣素治療組（C組，降鈣素溶于生理鹽水，2 μg/kg，皮下注射）、1,25維生素D治療組（D組，維生素D溶于花生油中，2 μg/kg，灌胃）、降鈣素和1,25維生素D聯合治療組（E組），每組25只。用正畸結扎絲結扎上頜磨牙牙頸部加高糖軟食的方法建立牙周炎大鼠模型。在第2、4、6和8周末各組處死5只大鼠，測量雙側上頜第一磨牙牙周探診深度（PD），觀察牙槽骨水平；第8周末各組采取10只大鼠腹部降主動脈血，用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）檢測血清中的骨堿性磷酸酶（BALP）及骨鈣素（OC）的濃度。結果4周、6周、8周時E組大鼠的PD低于B、C、D組（P＜0.05）。6周、8周時E組大鼠牙槽骨喪失水平低于B、C、D組（P＜0.05）。第8周時E組BALP及OC濃度顯著高于B、C、D組（P＜0.05）。結論降鈣素和1,25維生素D均能部分拮抗牙周炎導致的牙槽骨喪失，二者聯合應用效果更佳。

牙周炎；降鈣素；二羥膽鈣化醇類；牙槽骨質丟失；骨鈣素；堿性磷酸酶；1，25維生素D

牙周炎是最常見的口腔疾病之一，可導致牙槽骨的破壞吸收，造成牙齒松動脫落。近年研究表明，牙周炎引起的牙槽骨吸收，除各種炎性因子的作用外，其吸收程度還與宿主維生素C、維生素D的缺乏，鈣、磷的缺乏或不平衡等易感因素相關[1]。降鈣素與1,25維生素D可調節鈣代謝、維持血清鈣磷濃度的穩定，抑制骨吸收。目前關于降鈣素及維生素D對牙周炎導致牙槽骨喪失的影響尚少見報道。本研究擬通過建立大鼠牙周炎模型，并對其應用1,25維生素D及降鈣素，觀察牙周探診深度（probing depth，PD）、牙槽骨水平及血清骨代謝指標的變化情況，初步探索降鈣素和1,25維生素D對牙周炎導致的牙槽骨喪失的拮抗作用，為牙周炎的輔助治療探索一種新的可行方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年雄性Wistar大鼠125只，2月齡，體質量200～220 g，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。實驗動物以及實驗使用條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》。

1.2 藥品與儀器 骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司，大鼠特異性骨鈣素（osteocalcin，OC）EIA檢測試劑盒（美國BTI公司），多功能酶標儀（芯起點基因科技有限公司），降鈣素（批號H20040452，規格：50 U/mL，Novartis制藥，瑞士），1,25維生素D（骨化三醇，批號H20030491，規格：0.25μg/粒，青島正大海爾制藥）。

1.3 方法

1.3.1 牙周炎模型的建立及動物分組 將125只大鼠采用隨機數字表法隨機分成A、B、C、D、E 5組，每組25只。B、C、D、E組用10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）經腹腔注射麻醉，待大鼠進入麻醉狀態后，用直徑為0.2 mm的正畸結扎絲（在結扎絲上纏繞4-0醫用縫合線）環繞大鼠雙側上頜第一磨牙牙頸部結扎，頰側打結。A組麻醉后不做處理，待大鼠清醒后歸籠，并用普通顆粒飼料喂養。B、C、D、E組用致牙周病食譜（Keyes diet 2000）[2]喂養。至此，A組為空白對照組，B組為牙周炎組，C組為降鈣素組，D組為1,25維生素D組，E組為降鈣素和1,25維生素D聯合用藥組。

1.3.2 降鈣素和1,25維生素D治療 建模成功后，A組、B組每日灌服等劑量生理鹽水。C組：降鈣素溶于生理鹽水，2 μg/kg皮下注射，每日1次。D組：維生素D溶于花生油中，2 μg/kg灌胃，每日1次。E組：C組、D組治療方法合用。

1.3.3 觀察指標 每組分別于第2、4、6、8周各組處死5只大鼠，在10%水合氯醛全麻下采用自制的大鼠探針對大鼠雙側上頜第一磨牙臨床牙周指標進行檢測。（1）PD采用自制牙周探針測量各組大鼠上頜第一磨牙頰面遠中、近中、中央，舌面遠中、近中、中央6個位點的探診深度，取平均值。（2）大鼠處死后取上頜骨，去凈雙側磨牙區軟組織，用1%亞甲基藍液顯示牙槽嵴頂的位置。測量每顆牙頰面遠中、近中、中央，舌面遠中、近中、中央6個位點釉牙骨質界至牙槽嵴頂的距離，取6個位點測量值的均值作為該牙的牙槽骨喪失水平值。

1.3.4 ELISA法檢測血清BALP及OC的水平 經過8周治療，用水合氯醛對每組10只大鼠進行腹腔注射麻醉，切開腹腔，取腹部降主動脈血5～6 mL，靜脈注射空氣處死大鼠。動脈血3 000×g離心10 min，吸取上清液，-80℃深低溫冰箱中保存。擇日采用ELISA法進行血清中BALP及OC檢測。嚴格按照試劑盒操作說明進行。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件包分析數據，符合正態分布和方差齊性計量資料采用均數±標準差（±s）表示。多組資料間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠PD比較 用藥2周，B組大鼠的PD高于A組（P＜0.05）。B組與C、D、E組PD差異無統計學意義（P＞0.05）；用藥后4周、6周和8周，B組PD均高于A、C、D、E組（P＜0.05），且E組PD低于C組和D組，見表1。

Table 1 Comparison of probing depth between five groups of rats表1 5組大鼠用藥后PD變化比較 （n=5，mm±s）

Table 1 Comparison of probing depth between five groups of rats表1 5組大鼠用藥后PD變化比較 （n=5，mm±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組比較，均P＜0.05；表2、3同

組別A組B組C組D組E組F 2周0.20±0.01 0.57±0.01a0.56±0.02a0.56±0.01a0.56±0.02a3 403.986＊＊4周0.22±0.01 0.84±0.01a0.71±0.01ab0.72±0.01ab0.62±0.01abcd4 596.282＊＊6周0.22±0.01 1.12±0.04a0.90±0.04ab0.88±0.01abc0.81±0.01abcd1 720.205＊＊8周0.22±0.01 1.42±0.04a0.98±0.03ab0.96±0.01ab0.84±0.02abcd2 967.968＊＊

2.2 各組大鼠牙槽骨喪失水平比較 用藥2～4周，B組大鼠牙槽骨喪失水平高于A組（P＜0.05），B組與C、D、E組牙槽骨喪失水平差異無統計學意義（P＞0.05）；用藥6周和8周時，B組牙槽骨喪失水平高于C、D、E組（P＜0.05），且E組低于C組和D組，見表2。

Table 2 Comparison of alveolar bone loss between five groups of rats表2 5組大鼠用藥后牙槽骨喪失水平比較（n=5，mm±s）

Table 2 Comparison of alveolar bone loss between five groups of rats表2 5組大鼠用藥后牙槽骨喪失水平比較（n=5，mm±s）

組別A組B組C組D組E組F 2周0.20±0.01 0.52±0.01a0.53±0.02a0.53±0.01a0.52±0.01a1 829.375＊＊4周0.22±0.01 0.66±0.01a0.67±0.02a0.67±0.01a0.66±0.01a1 558.028＊＊6周0.23±0.01 0.89±0.01a0.76±0.02ab0.77±0.02ab0.71±0.01abcd2 421.820＊＊8周0.24±0.01 1.14±0.03a0.79±0.03ab0.81±0.02ab0.72±0.02abcd1 446.109＊＊

2.3 各組大鼠血清中BALP和OC水平比較 8周時，A組BALP、OC均高于B組；C、D組高于B組，E組高于C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

Table 3 Comparison of serum levels of BALP and OC between five groups of rats表35組大鼠血清中BALP和OC的水平比較（n=10s）

Table 3 Comparison of serum levels of BALP and OC between five groups of rats表35組大鼠血清中BALP和OC的水平比較（n=10s）

組別A組B組C組D組E組F BALP（ng/L）52.36±1.10 21.41±3.12a39.93±2.21ab29.65±2.33abc54.61±2.64abcd366.309＊＊OC（μg/L）76.27±1.73 62.51±2.51a70.67±1.83ab74.88±1.63bc78.42±2.24abcd97.291＊＊

3 討論

3.1 降鈣素對牙槽骨喪失的影響 降鈣素是甲狀腺C細胞產生的一種調節鈣磷代謝的多肽激素，其能促進骨骼吸收血漿中的鈣，使血鈣降低，從而抑制破骨細胞對骨的吸收。降鈣素受體的活化是通過抑制核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）實現的[3]。RANKL是激活破骨細胞的重要因素，能促進破骨細胞的活化和對骨組織的吸收。降鈣素通過阻斷RANKL途徑來促進骨組織的形成。本研究對牙周炎大鼠給予降鈣素處理后，其PD和牙槽骨喪失程度比牙周炎組明顯改善，說明降鈣素能有效抑制牙周炎癥的破骨過程。

3.2 1,25維生素D對牙槽骨喪失的影響 1,25維生素D即1,25-二羥基膽鈣化醇[1,25-(OH)2D3]是維生素D的活性形式，現已證實體內大多數細胞都含有維生素D受體[4-5]。1,25維生素D可調節小腸、腎臟和骨骼對鈣的吸收與代謝，促進骨骼生長和重構[6]。本研究對牙周炎大鼠給予1,25維生素D處理后，發現PD明顯減小，牙槽骨喪失程度也明顯改善，說明1,25維生素D對牙周炎癥引起的牙槽骨吸收也有一定的抑制作用。

3.3 降鈣素與1,25維生素D聯合用藥對牙槽骨喪失的影響 本研究發現聯合用藥組的PD和牙槽骨喪失水平較單一用藥組顯著減少，提示聯合用藥比單純降鈣素和1,25維生素D更能促進牙周炎大鼠牙槽骨成骨細胞的活性和功能。因為降鈣素能抑制破骨細胞對骨的吸收，1,25維生素D能促進小腸、腎臟和骨骼對鈣的吸收，促進骨的生長，兩者聯用可起到協同效應，共同抑制牙周炎導致的牙槽骨的吸收。

BALP作為成骨細胞的一種細胞外酶，在成骨細胞的成熟期合成，由成骨細胞分泌，其含量變化能直接反映成骨細胞活性。OC由成骨細胞在其基質礦化期分泌產生，具有促進骨礦化的作用。本研究發現降鈣素和1,25維生素D均能提高牙周炎大鼠血清中BALP和OC水平，聯合用藥組BALP與OC水平均高于降鈣素組和1,25維生素D組，提示降鈣素和1,25維生素D可能通過提升血清中的BALP和OC來促進骨的形成，且聯合用藥比單純用藥更能促進骨的形成。

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（2013-05-06收稿 2013-08-08修回）

（本文編輯 李鵬）

Observational Study of Calcitonin and 1,25 Vitamin D Preventing Periodontitis-Induced Alveolar Bone Loss in Rats

XU Chongyou,MA Yanhua,SHENG Junman,YIN Kai
The First Central Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo evaluate the effects of calcitonin and 1,25 vitamin D on the bone loss in experimental periodontitis in rats.MethodsA total of 125 male Wistar rats were randomly allocated to five groups according to the treatments during 8 weeks:normal control(group A,n=25),periodontitis(group B,n=25),calcitonin(group C,prepared in sterile saline at 2 mg/L,and 2 μg/kg was administered daily,s.c.,n=25),1,25 vitamin D(group D,prepared in corn oil daily at a concentration of 2 mg/L,and 2 μg/kg was administered daily,p.o.,n=25),1,25 vitamin D plus calcitonin(group E,n= 25).The experimental model of periodontitis was induced by ligating floss around mandibular first molars with orthodontic wires in B，C，D and E groups.Five rats from each group were sacrificed,and the specimens were prepared at 2,4,6 and 8-week.The probing depth(PD)and alveolar bone level were observed.The serum bone-specific alkaline phosphatase(BALP) and osteocalcin(OC)were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)at 8-week in each group.ResultsThe values of PD were significantly lower after 4,6 and 8 weeks in E group than those of B,C and D groups(P＜0.05).The alveolar bone loss was significantly lower after 6 and 8 weeks in group E compared with that of B,C and D groups(P＜0.05). The serum levels of BALP and OC were significantly higher after 8 weeks in E group than those of B,C and D groups(P＜0.05).ConclusionThe present study suggests that 1,25 vitamin D and calcitonin can partially inhibit the alveolar bone loss induced by periodontitis.Especially,the application of both is more effective than either drug treatment alone.

periodontitis；calcitonin；dihydroxycholecalciferols；alveolar bone loss；osteocalcin；alkaline phosphatase；1，25 vitamin D

R781.4

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.021

天津醫科大學一中心臨床學院（郵編300192）

△通訊作者 E-mail:ykxx5253@163.com