Chelex—100法提取DNA用于差異甲基化基因座檢測的研究

成振　嚴鵬　白麗娟等

[摘要] 目的 通過對Chelex-100提取法提取的DNA用于酶切的研究，為差異甲基化在法醫實際工作中的應用性研究提供一種快速提取酶切底物的方法。 方法 HhaⅠ酶切基因組DNA，PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，254 nm紫外燈下觀察。 結果 Chelex-100提取法提取的雜合子樣本DNA加酶組只觀察到來自父源的等位基因片段，而未加酶組能夠觀察到來自父源和母源的等位基因片段。 結論 Chelex-100提取法提取的DNA能夠作為酶切底物應用于差異甲基化基因座的研究。

[關鍵詞] 差異甲基化；聚合酶鏈反應；Chelex-100

[中圖分類號] R446.64 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）04（a）-0107-03

[Abstract] Objective To provide a method of rapid extraction of enzyme substrate for differential methylation applied research in forensic practice by the study of the Chelex-100 extraction to extract DNA. Methods Genomic DNA was digested by HhaⅠ，with PCR amplification，detected with 2% agarose gel electrophoresis and observed under ultraviolet lamp，whose wavelength was 254 nm. Results The DNA samples with enzyme extracted by Chelex-100 from heterozygous observed was only the paternal allele fragments，while the paternal and maternal allele fragments were observed in the control group. Conclusion The DNA extracted with Chelex-100 extraction can be used as enzyme substrate，which is applied to study the differential methylation gene loci.

[Key words] Differential methylation；polymerase chain reaction；Chelex-100

越來越多的研究資料表明，來自雙親的同源染色體或者等位基因有功能上的差異：有些只有父源的基因有轉錄活性，而母源的等位基因則一直處于沉默狀態，另一些基因的情況則相反。這是由于來源于某一親本的等位基因或其所在的染色體發生了表觀遺傳修飾，導致不同親本來源的兩個等位基因在子代細胞中表達不同。這種親緣依賴的差異表達現象被稱為基因組印記，受印記機制調控而差異表達的基因稱之為印記基因[1]，許多與印記基因和印記控制中心鄰近的序列存在DNA甲基化修飾及差異甲基化序列[2]，目前對于甲基化的研究多采用甲基化敏感性酶限制性內切酶-PCR法[3]。它是利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區不切割而對未甲基化區切割的特性，將DNA消化為大小不同的片段后再進行分析的一種研究甲基化的方法[4-5]。目前用甲基化敏感性限制性內切酶酶切的DNA大多是用有機溶劑法（酚/氯仿）提取或純化的DNA，而未見Chelex-100法提取DNA作為酶切底物應用于差異甲基化基因座檢測的報道。本研究對Chelex-100法提取的DNA應用于差異甲基化的檢測進行了分析。

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

100份無關人血由山西醫科大學法醫鑒定中心提供；HhaⅠ購自NEB公司；試驗中引物由英濰捷基（上海）貿易公司合成，OPC純度。Taq酶和Ex Taq Hot Start Version購自寶生物工程有限公司。

1.2 基因組DNA的提取

1.3 定量模板量

經典酚/氯仿法提取DNA的定量：紫外分光光度計測定OD260并定量；Chelex-100法提取DNA的定量：qPCR絕對定量。

1.4 篩選雜合子

1.5 對雜合子樣本基因組DNA用甲基化敏感酶Hha Ⅰ消化

1.6 對甲基化敏感酶HhaⅠ處理過的雜合子基因組DNA用AB引物進行PCR擴增

1.7 以AB引物的擴增產物為模板用CD引物進行PCR擴增

2 結果

6泳道只擴增出父源一方的等位基因，表明此位點確為差異甲基化位點。1、3泳道也只擴增出父源一方等位基因，表明HhaⅠ在Chelex-100法提取的DNA中也能夠工作，Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物用于差異甲基化基因座的檢測（圖1）。

3 討論

Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物應用于差異甲基化基因座的檢測，筆者認為有以下兩方面的原因：①法醫實際工作中用Chelex-100提取法提取的DNA一般用于進行PCR，PCR反應體系中DNA聚合酶一般除具有耐高溫的特性外，其他性質與一般的生物酶相類似。②影響限制性內切酶酶切反應效率的因素包括DNA純度、反應緩沖液、溫度、pH值等。其中提取的DNA中包含有蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、金屬離子等雜質，會影響限制性內切酶的活性，從而影響酶切反應的效率，而Chelex-100提取法提取的DNA中一般不會存在酚、氯仿、乙醇、SDS等物質，且Chelex-100會螯合Al、Ca、Zn、Mg、Cu、Fe、Ag、Be等常見的影響酶活性的金屬離子，在56℃水浴過程中加入PK，能夠使蛋白充分消化，減少蛋白對酶切反應的影響。100℃煮沸使蛋白變性，Chelex-100滅活，通過離心去除Chelex-100 顆粒，使這些和Chelex-100結合的物質與DNA分離，以免影響下一步的酶切反應。

隨著法醫實踐中應用甲基化敏感性酶限制性內切酶-PCR法對差異甲基化聯合STR位點[6]，差異甲基化聯合SNP位點的研究越來越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復雜、步驟繁多、耗費的時間較長，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機溶劑，這些物質都會對限制性內切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡單、檢材耗費少、省時省力的特點[9]，并且該方法中用到的試劑基本無毒。在法醫工作實踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實踐中已得到廣泛的應用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應用于法醫實踐提供了依據。

[參考文獻]

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[3] Zhao G，Huang D，Yang R，et al.Study on the application of parent-of-origin specific DNA methylation markers to forensic genetics[J].Forensic Sci Int，2003，154（2-3）：122-127.

[4] 趙書民，李成濤.DNA甲基化在法醫學中的應用前景及其檢測方法新進展[J].法醫學雜志，2009，25（4）：290-295.

[5] Naito E，Dewa K，Fukuda M，et al.Novel paternity testing by distinguishing parental alleles at a VNTR locus in the differentially methylated region upstream of the human H19 Gene[J].J Forensic Sci，2003，48（6）：1275-1279.

[6] 焦祖義.D15S128位點的STR多態性與差異甲基化聯合進行親子鑒定的研究[D].太原：山西醫科大學，2007.

[7] 趙貴森，艾紅偉，陳暉.SNP rs220028和 STR HUMARA位點甲基化標記的時空穩定性研究[J].醫學分子生物學雜志，2006，3（6）：419-422.

[8] Singer- Sam J，Tangua RL，Riggs AD.Use of chelex to improve the PCR signal from a small number of cells[J].Amplification，1989，3（1）：11-16.

[9] 周月琴，朱偉，劉志萍，等.用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J].復旦學報·醫學版，2003，30（4）：379-380.

[10] 鄭秀芬.法醫DNA分析[M].北京：中國人民公安大學出版社，2002：38-39.

（收稿日期：2014-01-17 本文編輯：袁 成）

隨著法醫實踐中應用甲基化敏感性酶限制性內切酶-PCR法對差異甲基化聯合STR位點[6]，差異甲基化聯合SNP位點的研究越來越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復雜、步驟繁多、耗費的時間較長，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機溶劑，這些物質都會對限制性內切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡單、檢材耗費少、省時省力的特點[9]，并且該方法中用到的試劑基本無毒。在法醫工作實踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實踐中已得到廣泛的應用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應用于法醫實踐提供了依據。

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（收稿日期：2014-01-17 本文編輯：袁 成）

隨著法醫實踐中應用甲基化敏感性酶限制性內切酶-PCR法對差異甲基化聯合STR位點[6]，差異甲基化聯合SNP位點的研究越來越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復雜、步驟繁多、耗費的時間較長，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機溶劑，這些物質都會對限制性內切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡單、檢材耗費少、省時省力的特點[9]，并且該方法中用到的試劑基本無毒。在法醫工作實踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實踐中已得到廣泛的應用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應用于法醫實踐提供了依據。

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[9] 周月琴，朱偉，劉志萍，等.用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J].復旦學報·醫學版，2003，30（4）：379-380.

[10] 鄭秀芬.法醫DNA分析[M].北京：中國人民公安大學出版社，2002：38-39.

（收稿日期：2014-01-17 本文編輯：袁 成）