沙門菌屬stn基因LAMP在食品衛生檢驗中的應用

王勝啟　馬艷艷　李靜等

[摘要] 目的 評價LAMP在食品衛生沙門菌屬檢驗中的應用效果。 方法 選擇145份食品標本，采用LAMP方法和分離培養法進行檢測，比較兩種檢測方法的陽性率。 結果 LAMP陽性率為12.4%，分離培養法陽性率為6.2%。兩種方法比較差異有統計學意義（P < 0.05）。兩種方法的陽性符合率為77.8%，陰性符合率為91.9%。 結論LAMP法用于食品衛生沙門菌屬的檢驗，具有快速、方便、陽性率高等優點。

[關鍵詞] 沙門菌屬；環介導等溫擴增；分離培養；食品衛生檢驗

[中圖分類號] R155.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我國已發現的血清型有216個。傳統對沙門菌的檢測主要有分離培養方法，雖然準確但是程序繁瑣，而免疫學方法的敏感度相對較低，PCR等敏感度和特異度均較高，但是設備要求較高，在基層不容易推廣應用[2，3]。環介導等溫擴增法（LAMP）是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點[4]。本研究比較環介導等溫擴增法檢測食品標本沙門菌屬與分離培養法的一致性，探討其在食品衛生檢驗中的應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

2013年6～8月選擇145份食品標本，其中冷凍生肉20份，生鮮肉20份，熟肉20份，非發酵豆制品20份，速凍米面20份，生水產品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鮮榨果汁10份，生食類蔬菜5份。陽性控制菌株：腸炎沙門菌。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本前增菌 將收集到的標本取25 g，裝入無菌均質袋中，拍擊式均質器拍打2 min，37℃培養10 h。冷凍食品在45℃下解凍15 min。

1.2.2 分離培養法 將增菌后的145份標本取1 mL，接種于10 mL的TTB增菌液中，42℃培養24 h。另取1 mL，接種于10 mL的SC增菌液中，37℃培養24 h。分別取增菌液1環，接種于BS平板和XLD平板，37℃培養24 h。取可疑菌落3個，接種于TSI、營養瓊脂平板和賴氨酸脫羧酶試驗培養基，37℃培養24 h。對于生化反應初步符合沙門菌特征的，從營養瓊脂平板上取可疑菌落，生理鹽水制成菌懸液，在微生物鑒定系統上進行分析。如果BS平板及XLD平板上無可疑菌落，BS平板37℃繼續培養24 h，如果仍無可疑菌落則為陰性。

1.2.3 LAMP檢測方法 取標本前增菌液1 mL，離心，10 000 r/min，2 min，棄上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待檢模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。檢測145份標本DNA。反應結束后，肉眼觀察反應液為綠色者為陽性，無色或者棕色者為陰性。或者采用電泳方法進行鑒定，電泳圖片顯示最小片段>100 bp的特征性梯狀為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同標本兩種方法檢測陽性結果

見表1。LAMP陽性率為12.4%，分離培養法陽性率為6.2%。兩種方法比較差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

沙門菌病是指由各種類型沙門菌所引起的對人類、家畜及野生禽獸不同形式感染的總稱。感染沙門菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發生食物中毒[5，6]。細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列榜首，引起腸傷寒、腸胃炎和敗血癥，也可傳染人類以外的其他多種動物。沙門菌通過消化道傳染致病[7，8]。

環介導等溫擴增技術是2000年由日本榮研化學株式會社開發的一種新的恒溫核酸擴增方法，其針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下保溫30～60 min，完成擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等，具有簡單、快速、特異性強的特點。其靈敏度、特異性和檢測范圍等甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備，可以現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。袁發滸等[9]探討了腸炎沙門菌的LAMP檢測方法的建立，認為LAMP法可快速特異地檢測出腸炎沙門菌，該方法反應靈敏度高，可用于食品中腸炎沙門菌的快速檢測。黃金海等[10]探討LAMP快速檢測方法在食品中沙門菌檢測中的應用，結果顯示該方法僅對沙門菌產生特異性擴增，所建立的檢測沙門菌方法具有較高的特異性與靈敏性，操作簡單、快速，可用于沙門菌污染食品的快速檢測。李雪等[11]分別采用LAMP法、PCR和國標法對市場上銷售的雞蛋蛋殼及內容物進行沙門菌的檢測，LAMP和PCR的沙門菌檢出率均高于國標法，而LAMP法敏感性、特異性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一種快速、敏感和高度特異性的沙門菌檢測方法。田楨干等[12]探討了LAMP技術快速檢測沙門菌方法的建立及其應用，沙門菌屬6種不同血清型菌株LAMP檢測都呈陽性，其他4種腸道細菌均為陰性；LAMP法的靈敏度與RT-PCR方法接近，達103 CFU/mL，是膠體金檢測法的100～1000倍；54株沙門菌臨床分離樣本實驗符合率達100%。

細菌分離培養是常用的一種檢測方法，但是其程序復雜，不能用于快速檢測，其得出陽性結果需要7 d時間，并且細菌分離需要將兩次增菌后再分離培養，其生化鑒定程序繁瑣，鑒定系統昂貴，不利于在基層推廣[9，10]。LAMP法對前增菌液進行核酸提取后就可以進行擴增，在60 min就可以完成擴增，在24 h內就可以檢出沙門菌屬，具有更加快捷的優點。并且在結果的判定中，可以肉眼觀察，更方便和直觀。本研究將LAMP方法與細菌分離培養方法進行比較，對145份食品進行沙門菌的檢測。結果顯示，兩種檢測方法的陽性率存在顯著差異，LAMP法的陽性率顯著高于細菌分離培養法，而以細胞分離培養做參照，對兩種檢測方法的陽性符合率和陰性符合率進行分析，顯示兩種方法的陽性符合率為77.8%，而兩組的陰性符合率高達91.9%。

綜上所述，LAMP法用于食品衛生沙門菌屬的檢驗，具有快速、方便、陽性率高等優點，可以用于食品衛生的初步檢驗，對于陽性結果的可進一步通過細菌培養法進行菌株分離及鑒定分型。endprint

[摘要] 目的 評價LAMP在食品衛生沙門菌屬檢驗中的應用效果。 方法 選擇145份食品標本，采用LAMP方法和分離培養法進行檢測，比較兩種檢測方法的陽性率。 結果 LAMP陽性率為12.4%，分離培養法陽性率為6.2%。兩種方法比較差異有統計學意義（P < 0.05）。兩種方法的陽性符合率為77.8%，陰性符合率為91.9%。 結論LAMP法用于食品衛生沙門菌屬的檢驗，具有快速、方便、陽性率高等優點。

[關鍵詞] 沙門菌屬；環介導等溫擴增；分離培養；食品衛生檢驗

[中圖分類號] R155.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我國已發現的血清型有216個。傳統對沙門菌的檢測主要有分離培養方法，雖然準確但是程序繁瑣，而免疫學方法的敏感度相對較低，PCR等敏感度和特異度均較高，但是設備要求較高，在基層不容易推廣應用[2，3]。環介導等溫擴增法（LAMP）是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點[4]。本研究比較環介導等溫擴增法檢測食品標本沙門菌屬與分離培養法的一致性，探討其在食品衛生檢驗中的應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

2013年6～8月選擇145份食品標本，其中冷凍生肉20份，生鮮肉20份，熟肉20份，非發酵豆制品20份，速凍米面20份，生水產品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鮮榨果汁10份，生食類蔬菜5份。陽性控制菌株：腸炎沙門菌。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本前增菌 將收集到的標本取25 g，裝入無菌均質袋中，拍擊式均質器拍打2 min，37℃培養10 h。冷凍食品在45℃下解凍15 min。

1.2.2 分離培養法 將增菌后的145份標本取1 mL，接種于10 mL的TTB增菌液中，42℃培養24 h。另取1 mL，接種于10 mL的SC增菌液中，37℃培養24 h。分別取增菌液1環，接種于BS平板和XLD平板，37℃培養24 h。取可疑菌落3個，接種于TSI、營養瓊脂平板和賴氨酸脫羧酶試驗培養基，37℃培養24 h。對于生化反應初步符合沙門菌特征的，從營養瓊脂平板上取可疑菌落，生理鹽水制成菌懸液，在微生物鑒定系統上進行分析。如果BS平板及XLD平板上無可疑菌落，BS平板37℃繼續培養24 h，如果仍無可疑菌落則為陰性。

1.2.3 LAMP檢測方法 取標本前增菌液1 mL，離心，10 000 r/min，2 min，棄上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待檢模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。檢測145份標本DNA。反應結束后，肉眼觀察反應液為綠色者為陽性，無色或者棕色者為陰性。或者采用電泳方法進行鑒定，電泳圖片顯示最小片段>100 bp的特征性梯狀為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同標本兩種方法檢測陽性結果

見表1。LAMP陽性率為12.4%，分離培養法陽性率為6.2%。兩種方法比較差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

沙門菌病是指由各種類型沙門菌所引起的對人類、家畜及野生禽獸不同形式感染的總稱。感染沙門菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發生食物中毒[5，6]。細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列榜首，引起腸傷寒、腸胃炎和敗血癥，也可傳染人類以外的其他多種動物。沙門菌通過消化道傳染致病[7，8]。

環介導等溫擴增技術是2000年由日本榮研化學株式會社開發的一種新的恒溫核酸擴增方法，其針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下保溫30～60 min，完成擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等，具有簡單、快速、特異性強的特點。其靈敏度、特異性和檢測范圍等甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備，可以現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。袁發滸等[9]探討了腸炎沙門菌的LAMP檢測方法的建立，認為LAMP法可快速特異地檢測出腸炎沙門菌，該方法反應靈敏度高，可用于食品中腸炎沙門菌的快速檢測。黃金海等[10]探討LAMP快速檢測方法在食品中沙門菌檢測中的應用，結果顯示該方法僅對沙門菌產生特異性擴增，所建立的檢測沙門菌方法具有較高的特異性與靈敏性，操作簡單、快速，可用于沙門菌污染食品的快速檢測。李雪等[11]分別采用LAMP法、PCR和國標法對市場上銷售的雞蛋蛋殼及內容物進行沙門菌的檢測，LAMP和PCR的沙門菌檢出率均高于國標法，而LAMP法敏感性、特異性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一種快速、敏感和高度特異性的沙門菌檢測方法。田楨干等[12]探討了LAMP技術快速檢測沙門菌方法的建立及其應用，沙門菌屬6種不同血清型菌株LAMP檢測都呈陽性，其他4種腸道細菌均為陰性；LAMP法的靈敏度與RT-PCR方法接近，達103 CFU/mL，是膠體金檢測法的100～1000倍；54株沙門菌臨床分離樣本實驗符合率達100%。

細菌分離培養是常用的一種檢測方法，但是其程序復雜，不能用于快速檢測，其得出陽性結果需要7 d時間，并且細菌分離需要將兩次增菌后再分離培養，其生化鑒定程序繁瑣，鑒定系統昂貴，不利于在基層推廣[9，10]。LAMP法對前增菌液進行核酸提取后就可以進行擴增，在60 min就可以完成擴增，在24 h內就可以檢出沙門菌屬，具有更加快捷的優點。并且在結果的判定中，可以肉眼觀察，更方便和直觀。本研究將LAMP方法與細菌分離培養方法進行比較，對145份食品進行沙門菌的檢測。結果顯示，兩種檢測方法的陽性率存在顯著差異，LAMP法的陽性率顯著高于細菌分離培養法，而以細胞分離培養做參照，對兩種檢測方法的陽性符合率和陰性符合率進行分析，顯示兩種方法的陽性符合率為77.8%，而兩組的陰性符合率高達91.9%。

綜上所述，LAMP法用于食品衛生沙門菌屬的檢驗，具有快速、方便、陽性率高等優點，可以用于食品衛生的初步檢驗，對于陽性結果的可進一步通過細菌培養法進行菌株分離及鑒定分型。endprint

[摘要] 目的 評價LAMP在食品衛生沙門菌屬檢驗中的應用效果。 方法 選擇145份食品標本，采用LAMP方法和分離培養法進行檢測，比較兩種檢測方法的陽性率。 結果 LAMP陽性率為12.4%，分離培養法陽性率為6.2%。兩種方法比較差異有統計學意義（P < 0.05）。兩種方法的陽性符合率為77.8%，陰性符合率為91.9%。 結論LAMP法用于食品衛生沙門菌屬的檢驗，具有快速、方便、陽性率高等優點。

[關鍵詞] 沙門菌屬；環介導等溫擴增；分離培養；食品衛生檢驗

[中圖分類號] R155.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我國已發現的血清型有216個。傳統對沙門菌的檢測主要有分離培養方法，雖然準確但是程序繁瑣，而免疫學方法的敏感度相對較低，PCR等敏感度和特異度均較高，但是設備要求較高，在基層不容易推廣應用[2，3]。環介導等溫擴增法（LAMP）是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點[4]。本研究比較環介導等溫擴增法檢測食品標本沙門菌屬與分離培養法的一致性，探討其在食品衛生檢驗中的應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

2013年6～8月選擇145份食品標本，其中冷凍生肉20份，生鮮肉20份，熟肉20份，非發酵豆制品20份，速凍米面20份，生水產品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鮮榨果汁10份，生食類蔬菜5份。陽性控制菌株：腸炎沙門菌。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本前增菌 將收集到的標本取25 g，裝入無菌均質袋中，拍擊式均質器拍打2 min，37℃培養10 h。冷凍食品在45℃下解凍15 min。

1.2.2 分離培養法 將增菌后的145份標本取1 mL，接種于10 mL的TTB增菌液中，42℃培養24 h。另取1 mL，接種于10 mL的SC增菌液中，37℃培養24 h。分別取增菌液1環，接種于BS平板和XLD平板，37℃培養24 h。取可疑菌落3個，接種于TSI、營養瓊脂平板和賴氨酸脫羧酶試驗培養基，37℃培養24 h。對于生化反應初步符合沙門菌特征的，從營養瓊脂平板上取可疑菌落，生理鹽水制成菌懸液，在微生物鑒定系統上進行分析。如果BS平板及XLD平板上無可疑菌落，BS平板37℃繼續培養24 h，如果仍無可疑菌落則為陰性。

1.2.3 LAMP檢測方法 取標本前增菌液1 mL，離心，10 000 r/min，2 min，棄上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待檢模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。檢測145份標本DNA。反應結束后，肉眼觀察反應液為綠色者為陽性，無色或者棕色者為陰性。或者采用電泳方法進行鑒定，電泳圖片顯示最小片段>100 bp的特征性梯狀為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同標本兩種方法檢測陽性結果

見表1。LAMP陽性率為12.4%，分離培養法陽性率為6.2%。兩種方法比較差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

沙門菌病是指由各種類型沙門菌所引起的對人類、家畜及野生禽獸不同形式感染的總稱。感染沙門菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發生食物中毒[5，6]。細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列榜首，引起腸傷寒、腸胃炎和敗血癥，也可傳染人類以外的其他多種動物。沙門菌通過消化道傳染致病[7，8]。

環介導等溫擴增技術是2000年由日本榮研化學株式會社開發的一種新的恒溫核酸擴增方法，其針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下保溫30～60 min，完成擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等，具有簡單、快速、特異性強的特點。其靈敏度、特異性和檢測范圍等甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備，可以現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。袁發滸等[9]探討了腸炎沙門菌的LAMP檢測方法的建立，認為LAMP法可快速特異地檢測出腸炎沙門菌，該方法反應靈敏度高，可用于食品中腸炎沙門菌的快速檢測。黃金海等[10]探討LAMP快速檢測方法在食品中沙門菌檢測中的應用，結果顯示該方法僅對沙門菌產生特異性擴增，所建立的檢測沙門菌方法具有較高的特異性與靈敏性，操作簡單、快速，可用于沙門菌污染食品的快速檢測。李雪等[11]分別采用LAMP法、PCR和國標法對市場上銷售的雞蛋蛋殼及內容物進行沙門菌的檢測，LAMP和PCR的沙門菌檢出率均高于國標法，而LAMP法敏感性、特異性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一種快速、敏感和高度特異性的沙門菌檢測方法。田楨干等[12]探討了LAMP技術快速檢測沙門菌方法的建立及其應用，沙門菌屬6種不同血清型菌株LAMP檢測都呈陽性，其他4種腸道細菌均為陰性；LAMP法的靈敏度與RT-PCR方法接近，達103 CFU/mL，是膠體金檢測法的100～1000倍；54株沙門菌臨床分離樣本實驗符合率達100%。

細菌分離培養是常用的一種檢測方法，但是其程序復雜，不能用于快速檢測，其得出陽性結果需要7 d時間，并且細菌分離需要將兩次增菌后再分離培養，其生化鑒定程序繁瑣，鑒定系統昂貴，不利于在基層推廣[9，10]。LAMP法對前增菌液進行核酸提取后就可以進行擴增，在60 min就可以完成擴增，在24 h內就可以檢出沙門菌屬，具有更加快捷的優點。并且在結果的判定中，可以肉眼觀察，更方便和直觀。本研究將LAMP方法與細菌分離培養方法進行比較，對145份食品進行沙門菌的檢測。結果顯示，兩種檢測方法的陽性率存在顯著差異，LAMP法的陽性率顯著高于細菌分離培養法，而以細胞分離培養做參照，對兩種檢測方法的陽性符合率和陰性符合率進行分析，顯示兩種方法的陽性符合率為77.8%，而兩組的陰性符合率高達91.9%。

綜上所述，LAMP法用于食品衛生沙門菌屬的檢驗，具有快速、方便、陽性率高等優點，可以用于食品衛生的初步檢驗，對于陽性結果的可進一步通過細菌培養法進行菌株分離及鑒定分型。endprint