ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系Notch－1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及HIF－1α表達(dá)的影響

閆 鵬 喬 嫻 孫圣剛 劉金玲 鄭 瑾

阿爾茨海默病（Ahzheimer’s Disease，AD）是老年期癡呆的主要類型，其發(fā)病機(jī)制至今仍不甚明了，β淀粉樣蛋白（Amyloidβprotein，Aβ）沉積是其主要的病理特征之一，而這同時也是AD較為公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制假說之一［1，2］。目前越來越多的研究表明，在Aβ的生成、代謝鏈中 Aβ寡聚體（Aβoli－gomers）即 ADDLs（Aβ－derived diffusible ligands）為主要的毒性形式［3，4］，在AD的發(fā)病中扮演重要角色，而非β淀粉樣蛋白單體或纖維狀β淀粉樣蛋白。鑒于此，本研究應(yīng)用ADDLs模擬AD的體外細(xì)胞模型。

HIF－1α是在缺氧情況下調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)的一種主要調(diào)控因子，其被認(rèn)為在多種情況下可發(fā)揮保護(hù)作用［5～10］。但近來有研究發(fā)現(xiàn)其可能有雙面作用［6，10］，這意味著在某些情況下 HIF－1α可能是有害的。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦部的微循環(huán)中HIF－1α升高［11，12］。另外，還有研究發(fā)現(xiàn) Aβ1－42可使星形膠質(zhì)細(xì)胞的 HIF－1α表達(dá)一過性升高［13］。HIF－1α在 AD發(fā)病中所扮演的角色仍有待進(jìn)一步的研究探討。Notch－1信號通路是一條與發(fā)育相關(guān)的通路，其在干細(xì)胞和胚胎發(fā)育等方面研究相對較多，但其通路成份在成年腦內(nèi)仍有表達(dá)而且具備活性［14］，此通路依靠Notch－1剪切為NICD繼而向胞內(nèi)進(jìn)一步傳遞信號而發(fā)揮作用。正常情況下隨著年齡的增長腦內(nèi)Notch－1信號通路及APP的關(guān)鍵剪切酶γ分泌酶活性會呈現(xiàn)出與年齡相關(guān)的降低［15］，但在AD患者的腦內(nèi)Notch－1的剪切水平顯著提高［14］。這說明Notch－1信號通路在AD的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)在其他系統(tǒng)中HIF－1α和Notch－1信號通路存在交互作用，且具有重要意義［16］。本研究以原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系為平臺，初步探討了ADDLs毒性作用對共培養(yǎng)體系中Notch－1信號傳導(dǎo)水平和HIF－1α蛋白表達(dá)的影響，以期為相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新生小鼠（P0－P2）購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基、胎牛血清及青鏈雙抗均購自Hyclone公司；F12培養(yǎng)基、Neurobasal無血清培養(yǎng)基及B27添加劑購自GIBCO公司；多聚賴氨酸及Aβ1－42蛋白購自sigma公司；HFIP（六氟異丙醇）購自Santa Cruz；Notch－1抗體購自 Epitomic公司，HIF－1α 抗體購自 Ebioscience公司；CCK－8試劑盒購自SAB公司。

1.2 ADDLs制備

依照既往文獻(xiàn)所報道方法［17］制備ADDLs。制備方法簡述如下：首先于冰上將Aβ1－42單體蛋白溶于HFIP至1 mmol／L，室溫放置約1 h使其充分溶解，而后于4℃通風(fēng)廚內(nèi)使溶劑充分揮發(fā)完畢至成為干燥膜狀，－80℃保存；用前以DMSO溶解干燥的膜狀藥物至5 mmol／L，充分振蕩溶解后以4℃無酚紅的F12培養(yǎng)基將藥物進(jìn)一步溶解至100 μmol／L，4℃孵育過夜；然后14 000 r／min離心10 min去除不溶性聚合物，留取上清即為ADDLs的F12溶液，保存于4℃；以BCA法測定ADDLs溶液的蛋白濃度；鑒于ADDLs的異質(zhì)性，其摩爾濃度為其相應(yīng)初始Aβ1－42單體蛋白的摩爾濃度（一般來說，ADDLs的產(chǎn)率大概為55%～75%）。

1.3 小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系的原代培養(yǎng)

初生2 d以內(nèi)的新生小鼠以75%酒精噴灑全身消毒，置于超凈臺中快速斷頭后將頭顱置于HBSS解剖液中（冰上操作），解剖出完整腦組織，分離出大腦半球，仔細(xì)剝除表面腦膜及血管，剪碎至約1 mm3組織塊，以0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min，后以等量體積種植培養(yǎng)基【含10%胎牛血清的DMEM／F12（1∶1）】終止消化，以適當(dāng)?shù)牧Χ确磸?fù)吹打至組織塊基本消失，200目濾網(wǎng)過濾后將懸液于1000 r／min離心8 min，棄上清，以種植培養(yǎng)基將沉淀重懸均勻，再次以800 r／min離心4 min，棄上清，以種植培養(yǎng)基再次重懸，輕柔吹打均勻，計數(shù)，接種于預(yù)先經(jīng)0.05 mg／ml多聚賴氨酸包被的孔板中；6孔板的種植密度約為2×106／ml，96孔板的接種密度約為1×105／ml；6孔板中每孔含培養(yǎng)基2 ml，96孔板中每孔內(nèi)含培養(yǎng)基100μl；接種并于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～6 h后給予全量更換維持培養(yǎng)基（含2%體積B27的Neurobasal培養(yǎng)基）；此后每周給予1／3量更換維持培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞活力評估

采用CCK－8法對混合培養(yǎng)體系的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。接種于96孔板的原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系，于持續(xù)培養(yǎng)第7 d給予不同濃度ADDLs干預(yù)；而后每個孔中添加10 μl CCK－8溶液并額外孵育2 h后以酶標(biāo)儀檢測各孔的450 nm吸光值；相應(yīng)實驗孔吸光值－無細(xì)胞空白對照孔吸光值＝細(xì)胞活力。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

6孔板細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時間點并完成相應(yīng)藥物干預(yù)等程序后應(yīng)用含有1%PMSF的RIPA裂解緩沖液分別提取各培養(yǎng)孔的細(xì)胞總蛋白，后以BCA法測定蛋白水平。4℃條件下應(yīng)用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，每個電泳孔加樣50μg總蛋白樣本，電泳完畢后以濕轉(zhuǎn)法將凝膠內(nèi)的目的蛋白轉(zhuǎn)膜至相應(yīng)的PVDF膜上；PVDF膜以含5%脫脂奶粉的TBST于室溫條件下封閉2 h；以相應(yīng)濃度的一抗［Notch－1（1∶200）and HIF－1α（1∶800）］4℃孵育過夜；以TBST漂洗5次，每次6 min，之后應(yīng)用HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗于室溫孵育1 h。再次以TBST漂洗5次（每次6 min）后以ECL發(fā)光法顯影并以X膠片曝光；以GAPDH為蛋白內(nèi)參，每組實驗重復(fù)3次。

1.6 qPCR檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase－3 mRNA水平

6孔板細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時間點并完成相應(yīng)藥物干預(yù)等程序后應(yīng)用Trizol抽提法提取總RNA，并進(jìn)行含量和純度測定。首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取4.643μg總 RNA，與 Oligo（d T）（10 u M）2μl、d NTP（2.5 m M）2μl混合，加dd H2O（無Rnase）至14.5μl，70℃5 min，短暫離心后置于冰上；后與5×RT buffer 4ul、HRP（RRI）／RNase inhibitor 0.5μl、M－MLV 1 μl及適量dd H2O（Rnase free）至20μl體系，反應(yīng)條件：42℃60 min，95℃5 min，獲取cDNA模板；Caspase－3 引 物 為 F（5’－TCTGACTGGAAAGCCGAAAC－3 ’）； R （5 ’－GACTGGATGAACCACGACCC－3’），產(chǎn)物204 bp；進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，總體系20μl，其中cDNA模板4μl，上下引物各0.4 μl，SYBR Green／Flourescein qPCR Master Mix（2X）10μl，RNase－free water定容至20μl，反應(yīng)條件為50℃2 min、95℃10 min，95℃30 s、60℃30 s，40個循環(huán)后在qPCR儀（BioRad iQ5）進(jìn)行擴(kuò)增并應(yīng)用△CT法分析；同時對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中獲取圖像，驗證目的基因片段的大小。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系光學(xué)顯微鏡觀察，見圖1。

2.2 不同水平ADDLs作用4 h對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞活力的影響（CCK－8法）

應(yīng)用不同水平ADDLs對原代混合培養(yǎng)體系干預(yù)4 h，后采用CCK－8法對各組細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。500 nmol／L及1μmol／LADDLs持續(xù)作用4 h對混合培養(yǎng)體系的細(xì)胞活力沒有明顯影響；當(dāng)ADDLs干預(yù)濃度達(dá)到2μmol／L或更高時，混合培養(yǎng)體系的細(xì)胞活力較空白對照組明顯減低，且減低程度與ADDLs的干預(yù)水平呈現(xiàn)出一致的趨勢（圖2）。

圖1 原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系（培養(yǎng)第7 d，×200倍）

圖2 CCK－8法測定ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系細(xì)胞活力的影響 500 n M組及1 u M組與空白對照組相比，差異均不顯著（P＞0.05）；2～20μM各組分別與空白對照組相比，差異均顯著（P＜0.01），且2～20μM各組之間的差異亦均具有顯著差異（P＜0.01）（n＝3）

2.3 10μmol／L ADDLs作用不同時間對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系總體NICD及HIF－1α蛋白水平的影響

10μmol／L ADDLs作用后原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系NICD及HIF－1α蛋白水平明顯升高，且隨干預(yù)時間呈現(xiàn)先升高后略減低的總體趨勢，二者表達(dá)的高峰均出現(xiàn)在ADDLs干預(yù)后8 h。8 h后二者蛋白水平有減低的趨勢，在24 h時，HIF－1α蛋白水平尚未降至與空白對照組一致的水平，但NICD在24 h的表達(dá)水平與空白對照組無明顯差別（P＞0.05）（圖3、4）。

圖3 10μmol／L ADDLs作用不同時間對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系總體HIF－1α蛋白水平的影響 各時間組之間HIF－1α蛋白水平的差異均顯著（P＜0.05）（n＝3）

圖4 10μmol／L ADDLs作用不同時間對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系總體NICD蛋白水平的影響 2、4、8及12 h組與空白對照相比，差異均顯著（P＜0.05）；2 h組與4 h組相比無明顯差異；8 h組與4 h組相比、8 h組與12 h組相比，差異均顯著（P＜0.05）；24 h組與空白對照相比無明顯差異（P＞0.05）（n＝3）

2.4 10μmol／L ADDLs作用不同時間對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系總體caspase－3 mRNA水平的影響

作為補(bǔ)充，我們對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系的總體caspase－3 m RNA水平進(jìn)行了檢測。10 μmol／L的ADDLs干預(yù)后4 h及24 h 2個時間點原代培養(yǎng)混合體系的總體caspase－3 mRNA水平均明顯升高，二者與空白對照組相比均具有顯著差異（P＜0.01）。但4 h和24 h組之間卻無顯著差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 10μmol／L ADDLs作用不同時間對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系總體caspase－3 mRNA水平的影響（real－time PCR）

3 討 論

阿爾茨海默病（AD）作為老年期癡呆的主要類型，其發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。既往的體內(nèi)及體外研究均提示 AD中可能存在 HIF－1α表達(dá)升高［11，12］，但仍有待進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗證。另外，還有研究表明AD中Notch－1信號通路有異常活化的情況［14］。這些研究綜合起來提示在AD的發(fā)病中HIF－1α表達(dá)升高和Notch－1信號通路的異常活化可能存在關(guān)聯(lián)。而近年來也有研究表明，在其他系統(tǒng)中HIF－1α和Notch信號通路存在交互作用，且具有重要意義［16］。

既往針對AD中Notch－1及HIF－1α的體外研究一般均采用單一種類的細(xì)胞培養(yǎng)體系。但是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞等其他細(xì)胞是有機(jī)的整體，所以本研究采用了原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系，以此在體外實驗中盡可能地模擬體內(nèi)狀況。

首先，CCK－8實驗表明低水平的ADDLs對原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力未表現(xiàn)出明顯的影響，而當(dāng)ADDLs干預(yù)水平超過2μM時，其表現(xiàn)出對原代培養(yǎng)混合體系細(xì)胞活力的明顯損害，且與干預(yù)水平呈現(xiàn)出一致的趨勢。這和既往類似研究的結(jié)論［18］基本一致。基于此，本研究應(yīng)用10μM ADDLs進(jìn)行了下一步的實驗內(nèi)容。

通過對不同特定時間點原代培養(yǎng)混合體系總蛋白的檢測，10μM ADDLs對混合培養(yǎng)體系中HIF－1α蛋白及NICD的水平表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的大概趨勢，且 HIF－1α蛋白及 NICD的變化趨勢與ADDLs干預(yù)時間的關(guān)系十分類似，兩種蛋白的最高水平均出現(xiàn)在“8 h”時間點，隨后隨著干預(yù)時間的進(jìn)一步延長，兩種蛋白的水平均呈現(xiàn)出進(jìn)行性下降的趨勢。其中，干預(yù)24 h時HIF－1α蛋白水平還未降至空白對照組的水平，而NICD的水平基本已降至與空白對照組一致的水平。Schubert等的研究發(fā)現(xiàn)ADDLs可一過性升高星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF－1α蛋白的表達(dá)水平，最高表達(dá)水平出現(xiàn)在ADDLs干預(yù)后4 h，而在干預(yù)24 h后HIF－1α蛋白水平較空白對照組還要更低［13］。這與本研究即類似又存在不同，根據(jù)實驗條件的不同，本研究推測這種不同可能與神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的互相作用有關(guān)。對比ADDLs干預(yù)后HIF－1α蛋白和NICD表達(dá)水平，二者呈現(xiàn)出基本一致的變化趨勢，這提示在ADDLs的作用下HIF－1α蛋白和Notch－1信號通路之間很可能有密切相關(guān)，故本研究結(jié)果初步驗證了之前的相關(guān)假設(shè)。

作為補(bǔ)充，本研究對原代培養(yǎng)混合體系不同狀況下凋亡相關(guān)蛋白caspase－3的mRNA水平進(jìn)行了檢測。10μM ADDLs作用后4 h，混合體系的總體caspase－3 mRNA水平明顯升高，提示10μM ADDLs作用4 h有效誘導(dǎo)了混合培養(yǎng)體系的總體凋亡水平。然而24 h后的總體caspase－3 m RNA水平較4 h并無明顯變化，提示ADDLs作用24 h所誘導(dǎo)的凋亡水平較4 h無明顯差別。結(jié)合既往關(guān)于ADDLs毒性作用的研究［18］和本研究 HIF－1α蛋白及NICD水平的檢測結(jié)果分析，這可能與ADDLs隨時間的聚合規(guī)律有關(guān)，即隨著孵育時間的延長，ADDLs水平逐漸降低，取而代之的是纖維化Aβ水平的升高，其細(xì)胞毒性較ADDLs明顯減低。而共培養(yǎng)體系中HIF－1α蛋白及NICD水平升高后又降低的趨勢可能也與ADDLs的聚合有關(guān)系，而具體情況還需要進(jìn)一步更細(xì)致的研究。

綜上所述，本研究以原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系為平臺，初步探討了ADDLs毒性作用對共培養(yǎng)體系中整體Notch－1信號通路和HIF－1α蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果為AD的ADDLs相關(guān)病理機(jī)制的研究提示了新的思路，這可能在AD的發(fā)病機(jī)制研究甚至防治方面有重要意義，但還需要利用更多的試驗方法和手段對進(jìn)一步的細(xì)節(jié)進(jìn)行探索。

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