糖耐量損害大鼠腦組織NF－κBp65及TNF－α表達水平與認知障礙的關系

魏 佳 董銀華 趙 嵐 王洪新

隨著人們生活水平提高，飲食結構改變，越來越多糖尿病患者出現，糖尿病成為眾多專家學者關注的焦點。糖尿病中樞神經系統并發癥成為人們近年研究的新領域，其中認知障礙是糖尿病中樞神經系統并發癥的重要表現之一［1，2］。糖耐量損害是介于正常血糖與糖尿病之間的一種代謝異常狀態，糖耐量損害是否與認知障礙有關，尚無明確報道。本研究通過建立糖耐量損害大鼠模型，從炎癥機制角度探討糖耐量損害與認知障礙的關系，為糖耐量損害的認知障礙的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 SPF級wistar雄性大鼠60只，體重180～200 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK－（軍）2007－004，隨機分為對照組和實驗組，每組各30只。適應性喂養1周（不計入實驗周期），對照組給予普通飼料，實驗組給予高脂高糖飼料，自由進水，室溫18～22℃，飼養20周。從第8周開始，以后每2周進行1次葡萄糖耐量實驗，測鼠尾血糖。空腹血糖6.2～7.5 mmol／L 或者餐后2 h血糖7.9～10.4mmol／l的大鼠提示造模成功［3］。

1.2 行為學檢測 對照組和實驗組分別于第5、10、15、20周采用自制簡易水迷宮試驗測定大鼠學習記憶能力，包括適應性訓練、定位航行訓練、空間探索試驗三部分。

1.3 大鼠腦組織石蠟切片 實驗組和對照組大鼠分別于第5、10、15、20周末采用斷頸取腦法，腦組織做石蠟切片。

1.4 免疫組化法檢測大鼠腦組織中NF－κBp65及TNF－α因子的表達水平 選用武漢博士德公司的免疫組化試劑盒檢測NF－κBp65及TNF－α的表達水平，空白對照以0.01 mol／L PBS代替一抗。操作步驟嚴格按說明書進行。每張切片在顯微鏡200倍視野下選5個互不重疊視野，以平均光密度值反映表達水平。

1.5 統計學處理

水迷宮試驗數據采用SPSS20.0軟件，根據重復測量的多因方差分析對數據進行分析，數據以±s表示，組間均數比較采用q檢驗。對大鼠腦組織 NF－κBp65、TNF－α陽性表達水平與認知障礙進行Pearson相關分析。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 糖耐量損害大鼠成模情況

高脂高糖飼料飼養10周大鼠成模率60%，飼養15周大鼠成模率100%。

2.2 自制水迷宮實驗

由表1和表2可知，第5周實驗組較對照組逃避潛伏期短，空間探索時間長，隨著飼養周期的延長，糖耐量損害大鼠逐漸成模，第15周實驗組大鼠全部成模，實驗組大鼠較對照組大鼠逃避潛伏期延長，空間探索時間縮短 （P＜0.05）；第20周時實驗組學習記憶能力顯著下降（P＜0.01）。

表1 大鼠定位航行實驗的逃避潛伏期（±s，n＝5，s）

表1 大鼠定位航行實驗的逃避潛伏期（±s，n＝5，s）

注：與同時間點對照組比較，＊P＜0.05，△P＞0.05，▲P＜0.01

組別 逃避潛伏期第1 d 第2 d 第3 d 第4 d 21實驗組 12.79±0.11＊ 5.21±1.1＊ 2.78±0.29＊ 2.1±0.07＊第10周對照組 15.69±0.28 5.35±0.72 3.41±0.27 2.96±0.17實驗組 22.55±0.54△ 5.65±0.16△ 3.90±1.70△ 2.85±0.32△第15周對照組 20.55±1.98 10.34±1.07 5.22±0.87 2.9±1.10實驗組 32.73±5.73＊11.75±1.90＊ 6.73±0.24＊ 4.53±0.34＊第20周對照組 20.12±3.85 12.38±2.74 5.43±0.92 3.01±0.98實驗組 68.23±5.66▲45.98±12.81▲ 14.03±2.79▲ 5.63±0.76第5周對照組 14.89±0.56 6.37±0.33 3.25±2.83 2.99±0.▲

表2 大鼠空間探索試驗2 min內大鼠穿過平臺所在象限的時間（s）

2.3 大鼠腦組織 NF－κBp65、TNF－α表達水平

NF－κBp65、TNF－α陽性表達為胞漿呈現棕黃色，強陽性時細胞核也出現棕黃色顆粒，胞核藍染。采用平均灰度值比較大鼠腦組織 NF－κBp65和TNF－α蛋白陽性表達水平。在第5周和第10周實驗組與對照組差異不明顯（P＞0.05），第15周實驗組與對照組有明顯差異（P＜0.05），第20周實驗組與對照組有顯著差異（P＜0.01）（圖1、2）。

圖1 空白對照（左）、對照組（中）與實驗組（右）大鼠大腦皮質NF－κBp65蛋白陽性表達水平（DAB染色×200倍）

圖2 空白對照（左）、對照組（中）與實驗組（右）大鼠大腦皮質TNF－α蛋白陽性表達水平（DAB染色×200倍）

2.4 NF－κBp65及 TNF－α的表達水平與認知功能之間的關系

Pearson直線相關回歸分析顯示，實驗組大鼠學習記憶成績與NF－κBp65陽性表達水平呈正相關（r＝0.972，P＜0.05），與 TNF－α陽性表達水平呈正相關（r＝0.975，P＜0.05），而對照組兩者無明顯相關性（r＝0.260，P＞0.05）。

3 討 論

糖耐量損害（IGT）是介于正常血糖與糖尿病之間的異常糖代謝狀態，不僅是糖尿病的高危人群，而且也較多地聚集了心、腦血管疾病的危險因素。英國前瞻性糖尿病研究發現，新診斷的2型糖尿病半數已有血管病變，提示血管病變可發生于糖尿病之前，即在IGT階段已經有炎性反應的發生，且可能與血管性認知障礙有關［4］。近年研究發現較多的炎性因子在胰島素抵抗和IGR的發生中具有重要作用，如C反應蛋白 、腫瘤壞死因子－a等都與糖耐量損害有關［5］。

NF－κB是一種廣泛的核轉錄因子，在靜息狀態下以二聚體狀態在細胞漿內與Ik B結合，激活后與IkB解離，NF－k B核因子定位序列暴露，NF－κB進入細胞核內，以二聚體的形式起轉錄調節作用，從而誘導白細胞介素－1、細胞間粘附分子、腫瘤壞死因子（TNF－α）等的表達，白細胞在各種炎性介質的介導下向血管內皮細胞移動、粘附并滲出，參與炎癥的的級聯反應，最終導致缺血性神經元的損傷。另外，各項因子如腫瘤壞死因子、白介素的表達反過來進一步增加NF－κB表達，從而進一步促進炎癥因子的表達，進一步加重炎癥反應，形成惡性循環［6～8］。

綜上所述，本研究通過觀察糖耐量損害大鼠腦組織NF－κBp65及TNF－α的陽性表達水平與大鼠學習記憶能力減退的關系，為糖耐量損害導致認知障礙的炎癥機制提供了理論依據，為血管性認知障礙的治療提供新的靶點。

1 孫海鷗，殷玉華，姬秋和，等.糖尿病腦病.國外醫學（內分泌學分冊），2004，24（2）：79－81.

2 Daniel J，Boris P，Linda A，et al.Relationships between hyper glycemia and cognitive performance among adults with type 1 and type 2 diabetes.Diabetes Care，2005，28（1）：71－77.

3 王 竹，楊月欣，向雪松，等.實驗大鼠血糖正常范圍的估算.衛生研究，2010，39（2）：133－137，142.

4 Debeng D，Amelang M，Hasselbach P，et al.Diabetes and cognitive function in a population－based study of elderly women and men.J Diabetes Complications，2006，20（4）：238－245.

5 Griffin WS.Inflammation and neurodegenerative disease.Am J Clin Nutr，2006，83（suppl）：470－474.

6 Cora H.Nijboer，Cobi J，et al.A dual role of the NF－kappa B pathway in neonatal hypoxic－ischemic brain damage.Stroke，2008，39（9）：2578－2586.

7 Kaltschmidt B，Kaltschmidt C.NF－κB in the Nervous System.Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2（1）：a001271.

8 Kaltschmidt B，Ndiaye D，Korte M，et al.NF－kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A／CREB signaling.Mol Cell Biol，2006，26（8）：2936－46.