葛根素預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制

常明則 田 曄 喬 琳 王新來 狄政莉 劉志勤 毛 佳 吳海琴

臨床上盡早促進缺血腦組織再灌注是急性腦梗死治療的核心措施及有效手段之一，但隨之可能繼發(fā)腦缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響其預(yù)后。腦缺血再灌注后的病理生理變化極其復(fù)雜，腦組織缺血缺氧引起的炎癥性反應(yīng)及氧自由基生物膜損害等是目前廣泛公認(rèn)的腦損傷機制［1，2］。目前，中藥對腦缺血再灌注損傷的保護作用研究仍備受關(guān)注，丹參提取物對腦缺血再灌注模型大鼠預(yù)處理可通過減輕氧化應(yīng)激損傷而具有神經(jīng)保護作用［3］。課題組在前期表明，葛根素后處理對大鼠全腦缺血再灌注損傷及慢性腦缺血損傷均具有明顯腦保護作用［4，5］，本研究擬通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，應(yīng)用神經(jīng)行為學(xué)、測定腦組織含水量及MDA手段來探討葛根素預(yù)處理是否具有腦保護作用及其劑量相關(guān)性？氧化應(yīng)激是否參與其腦保護機制？

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 葛根素：陜西安康正大制藥廠，水合氯醛：西安試劑廠，尼龍線栓：北京沙東生物技術(shù)有限公司，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所，分析天平（JA2003）：上海精科，內(nèi)切式組織勻漿機：德國Heidoph公司，分光光度計UV－WFZ75：上海復(fù)日科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組 健康雄性Sprague－Dawley大鼠120只，2月齡，體質(zhì)量250～300 g，清潔級，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物合格證號0008366。實驗前將大鼠置于實驗室適應(yīng)環(huán)境1周，自由進食、飲水，室溫（22＋2）℃，相對濕度65%，每天光照12 h。采用隨機數(shù)字表法分為5組：假手術(shù)組（S組），IR 組，Pc－24 h 100 mg組，Pc－24 h 200 mg組，Pc－24 h 400 mg組。

1.3 模型制備 （1）預(yù)處理：在缺血前24 h Pc－24 h 100 mg組、Pc－24 h 200 mg組及 Pc－24 h 400 mg組均分別給予葛根素100 mg·kg－1、200 mg·kg－1及400 mg·kg－1腹腔注射行單次預(yù)處理，I－R組于缺血90 min再灌注即刻給予等量生理鹽水腹腔注射。（2）動物模型：依據(jù) Zea－Longa線栓法［6］，參照課題組方法［7］；皮膚外留栓塞線頭長約6 mm；缺血時間90 min拔掉線栓，制備完成局灶性腦缺血再灌損傷模型。其中S組麻醉和手術(shù)過程同模型組，分離左側(cè)頸總動脈及頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，但不插栓線。造模后大鼠有下列情形之一者排除本研究：無神經(jīng)功能缺陷；出現(xiàn)意識喪失；開顱發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血；未達觀察時相點死亡。并通過隨機抽樣原則補齊。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評分 取材前對實驗大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分，依據(jù)課題組前期實驗研究［7］，選取Garcia評分法［8］，Garcia18分的評價法：最高18分，最低，3分。

1.5 2，3，5－氯化三苯基四氮唑法測定腦梗死體積百分比 術(shù)后24 h每組取8只大鼠，給予10%水合氯醛（0.50 ml／100 mg）腹腔注射，斷頭取腦，冰水沖洗；將腦組織標(biāo)本置于－20℃中20 min后取出，自前向后均勻冠狀切片，約每隔1.8 mm，共切6片；放置于1%2，3，5－氯化三苯基四氮唑法（2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride，TTC）磷酸緩沖液中，37.5℃避光下共孵育30 min；正常組織染成紅色，腦梗死組織為白色；腦切片經(jīng)數(shù)碼攝像后將圖像數(shù)據(jù)輸入計算機，用Image－pro plus 5.1軟件（美國Media Cybernetics公司）作圖像分析；將Image計算出的每一腦切片壞死區(qū)域面積乘以切片的厚度（1.8 mm），計算出腦梗死容積，累計每只大鼠所有腦切片的腦梗死容積即得全腦梗死容積，并計算腦梗死體積百分比（brain infarct volume percentage，BIVP）。

1.6 腦組織含水量測定 再灌注24 h時每組取8只大鼠，斷頭取缺血側(cè)大腦半球，電子天平稱其濕重后置于110℃恒溫箱燒烤24 h至恒重，稱其干重，計算腦組織含水量＝（濕重－干重）÷濕重×100%。

1.7 MDA活性水平測定 再灌注24 h時每組隨機取8只大鼠，斷頭取缺血側(cè)額葉組織20 mg，用冰生理鹽水制成1%溶漿，4℃4000 r／min離心15 min，離心半徑約9.5 cm，取上清液按照MDA測定試劑盒說明書實驗步驟分別測定左側(cè)額葉MDA水平。MDA水平測定用硫代巴比妥酸（TBA）法，于532 nm處用分光光度計測吸光度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件包，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，組間比較采用單因方差分析，SNK－q檢驗做兩兩比較，并應(yīng)用Correlate進行相關(guān)性分析。取P＜0.05為差顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評分、BIVP、腦組織含水量及 MDA水平 與S組比較，IR組和PC－24 h組神經(jīng)功能評分顯著下降，BIVP、腦組織含水量及MDA顯著升高（P 均＜0.01）；與IR組比較，PC－24 h組神經(jīng)功能評分顯著改善，BIVP、腦組織含水量及 MDA顯著降低（P均＜0.01）；在3組不同劑量預(yù)處理組中Pc－24 h400mg組神經(jīng)功能評分顯著改善，BIVP、腦組織含水量及 MDA顯著降低（P均＜0.01），其中神經(jīng)功能評分、BIVP及腦組織含水量在Pc－24 h 100 mg組及Pc－24 h 200 mg組中無顯著差異（P均＞0.05）（表1、表2及圖1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和BIVP（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和BIVP（±s）

注：與S組比較，■P＜0.01；與IR組比較，★P＜0.01；與Pc－24 h 100 mg組比較，▲P＜0.01

組別 神經(jīng)功能評分（n＝24）BIVP（%）（n＝8）00 0 IR組 8.37＋0.49■ 26.63＋0.92■Pc－24 h 100 mg組 8.95＋0.55■★ 22.75＋0.71■★Pc－24 h 200 mg組 9.20＋0.41■★ 22.62＋0.91■★Pc－24 h 400 mg組 11.95＋0.62■★▲ 20.75＋1.28 S組 18.00＋0.■★▲

表2 各組大鼠腦組織含水量及MDA水平（±s，n＝8）

表2 各組大鼠腦組織含水量及MDA水平（±s，n＝8）

注：與S組比較，■P＜0.01；與IR組比較，★P＜0.01；與Pc－24 h 100 mg組比較，▲P＜0.01

組別 腦組織含水量（%）MDA（umol·g－1 Pro）27 IR組 91.37＋3.25■ 5.14±0.65■Pc－24 h 100 mg組 88.12＋2.94■★ 4.55±0.41■★Pc－24 h 200 mg組 86.37＋3.62■★ 4.31±0.63■★▲Pc－24 h 400 mg組 79.50＋2.82■★▲ 4.16±0.05 S組 75.25＋2.18 1.82±0.■★▲

2.2 BIVP與MDA水平及腦組織含水量相關(guān)性分析 在IR組及葛根素預(yù)處理3組中將BIVP與大鼠腦組織MDA水平及腦組織含水量作相關(guān)分析顯示BIVP與腦組織MDA水平及腦組織含水量呈正相關(guān)（r＝0.744，P＝0.005，r＝0.901，P＝0.002）。

3 討 論

局灶性腦缺血時缺血半暗帶及鄰近腦組織內(nèi)繼發(fā)出現(xiàn)微細(xì)血管收縮，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜的穩(wěn)定性下降，細(xì)胞膜的失穩(wěn)定使進入細(xì)胞內(nèi)的游離水增多，能量代謝紊亂程度加重，使炎癥因子釋放增多，血腦屏障通透性增高，缺血腦組織含水量增多，該過程伴隨腦組織生物膜結(jié)構(gòu)及內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)受損，活性氧大量堆積，再灌注過程中缺血腦組織重新獲氧，激活黃嘌呤氧化酶，自由基清除動態(tài)平衡破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起氧自由基的過多生成，對自發(fā)性高血壓性腦卒中傾向大鼠腦缺血模型研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要機制［9］。生物膜中不飽和脂肪酸的氧化作用導(dǎo)致脂自由基的形成和延伸反應(yīng)，MDA為生物膜中的多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化后的終產(chǎn)物，檢測MDA水平可反映腦組織中氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映了線粒體呼吸鏈損傷的程度［10］。研究表明葛根素可以通過降低局灶性腦缺血大鼠中紋狀體興奮性氨基酸含量而對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用［11］。

本研究模型組腦含水量顯著高于假手術(shù)組，表明大腦中動脈線栓導(dǎo)致了腦水腫，葛根素100 mg／kg、200 mg／kg及400 mg／kg組腦含水量明顯低于IR組，提示葛根素預(yù)處理可以減輕腦缺血再灌注后腦水腫。實驗中對葛根素預(yù)處理進行了劑量相關(guān)研究，提示葛根素100 mg／kg、200 mg／kg及400 mg／kg三個劑量均具有保護作用，但隨著劑量增加，特別是葛根素400 mg／kg劑量預(yù)處理對神經(jīng)功能評分明顯改善，本研究中BIVP與腦組織MDA及含水量呈正相關(guān)，間接印證了葛根素預(yù)處理可能通過氧化應(yīng)激過程及腦水腫發(fā)生機制來縮小腦梗死體積。故本研究推測，葛根素可能通過清除氧自由基、抗氧化及減少脂質(zhì)過氧化機制，提高腦組織抗氧化能力，進而保護線粒體免于遭受進一步的破壞，減輕腦組織含水量，并最終發(fā)揮腦保護作用，其中部分劑量依賴對葛根素臨床應(yīng)用具有一定啟發(fā)作用。

本實驗初步證實了葛根素預(yù)處理能減輕局灶性腦缺血再灌注的腦保護機制可能與抑制MDA產(chǎn)生及抗腦水腫有關(guān)，為臨床早期應(yīng)用葛根素提供了重要的實驗依據(jù)，也間接推測葛根素作為中藥制劑可能為天然抗氧化劑？為今后葛根素預(yù)防性應(yīng)用腦梗死高危人群提供一定的理論依據(jù)。

圖1 各組大鼠腦組織冠狀位切片TTC染色

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4 吳海琴，常明則，張桂蓮，等.葛根素對大鼠全腦缺血再灌注后學(xué)習(xí)記憶障礙保護作用及其機制的研究.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2004，21（4）：350－352.

5 常明則，王新來，吳海琴.葛根素對血管性癡呆大鼠行為學(xué)及額葉細(xì)胞凋亡的影響.卒中與神經(jīng)疾病，2009，16（3）：151－154.

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7 喬 琳，胡 彬，常明則，等.二種神經(jīng)功能評分評價大鼠局灶性腦缺血模型的初步研究.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，43（12）：808－811.

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9 Zhang XH，Lei H，Liu AJ，et al.Increased oxidative stress is responsible for severer cerebral infarction in stroke－prone spontaneously hypertensive rats.CNS Neurosci Ther，2011，17（6）：590－598.

10 Karabulut AB，Kirimlioglu V，Kirimlioglu H，et al.Protective effects of resveratrol on spleen and ileum in rats subjected to ischemia－reperfusion.Transplant Proc，2006，38（2）：375－377.

11 Xu XH，Zheng XX，Zhou Q，et al.Inhibition of excitatory amino acid efflux contributes to protective effects of puerarin against cerebral ischemia in rats.Biomed Environ Sci，2007，20（4）：336－342.