DKK1基因干擾對原發性肝細胞癌細胞增殖的影響及其機制探討

邊立忠，高 松

(1淄博市齊都醫院，山東淄博255400;2青島市即墨疾病控制中心)

我國是原發性肝細胞癌(HCC)高發國家，全世界50%以上的新發和死亡 HCC發生在中國［1，2］。超過60%的HCC患者在初次就診時已經進入中晚期，其5年總生存率只有7%左右［3］。原癌基因的過表達和抑癌基因的表達下調或功能缺失都會導致HCC。DKK1在腫瘤進程中的作用已引起廣泛關注，但在腫瘤中的表達水平有很大差異，其作用機制尚未清楚。2011年3月～2013年8月，我們觀察了腺病毒介導的特異性抑制DKK1(shDKK1)基因對HCC細胞增殖的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎腎細胞株HEK293購自美國ATCC公司;人HCC細胞株SMMC-7721購自上海細胞庫;兔抗DKK1多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體、β-鏈蛋白(β-catenin)、C-Myc、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖細胞核抗原(PCNA)購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔IgGHRP、山羊抗鼠IgG-HRP抗體購自Santa Cruz;ECL化學發光顯色試劑盒購買自Millipore公司;各種限制性內切酶、DL5000 Marker、T4 DNA連接酶、RTPCR試劑盒購自大連寶生物公司;其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 DKK1基因shRNA載體構建 根據 Gene-Bank的DKK1 mRNA序列NM_012242，設計合成3對shRNA及1對對照引物。上游引物DKK1-1F:5'-GATCCCGGTTCTCAATTCCAACGCTATCAAGAGTAG CGTTGGAATTGAGAACCGTTTTTTA-3'，下游引物D KK1-1R:5'-AGCTTAAAAAACGGTTCTCAATTCC-AA CGCTACTCTTGATAGCGTTGGAATTGAGAACCGG-3';上游引物DKK1-2F:5'-GATCCCCAGAAGAACCACCTTGTCTTTCAAGAGAAGACAAGGTGGTTCTTTGGT-TTTTTA-3'，下游引物DKK1-2R:5'-AGCTTAAAAAA CCAGAAGAACCACCTTGTCTTCTCTTGAAAGACAAGGTGGTTCTTCTGGG-3';上游引物 DKK1-3F:5'-GATCCGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTTCAAGAGAAGCCTAGAAGAATTACTGGCTTTTTTA-3'，下 游 引 物DKK1-3R:5'-AGCTTAAAAAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCTC TTGAAAGCCTAGAAGAATTACTGGCG-3';對照上游引物Control-F:5'-GATCCCAAATACGAGAGGAGTACCCTTCAAGAGAGGGTACTCCTCTCGTATTTGTTTTTTA-3'，對照下游引物 Control-R:5'-AGCTTAAAAAACAAATACGAGAGGAGTACCCTCTCTTGAAGGGTACTCCTCTCGTATTTGG-3'。合成的單鏈目的基因片段經溶解、雙酶切等，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，并提交至上海生物工程有限公司測序驗證。陽性質粒分別命名為pGeneSil-DKK1-1、pGeneSil-DKK1-2、pGeneSil-DKK1-3、pGeneSil-CON，完全符合設計要求。

1.2.2 細胞分組及shRNA轉染 SMMC-7721細胞株孵育傳代，轉染前1 d接種到6孔板中，培養24 h后，細胞密度達到80% ～90%。將細胞分為A、B、C、D 組，分別轉染 pGeneSil-DKK1-1、pGeneSil-DKK1-2、pGeneSil-DKK1-3、pGeneSil-CON，嚴格按照LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑說明書操作。于倒置熒光顯微鏡下觀察SMMC-7721細胞中綠色熒光蛋白報告基因的表達，顯示48 h時均有較強熒光表達，其轉染率約為70%(見插頁Ⅱ圖4)。

1.2.3 DKK1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。依照TRIzol操作說明提取細胞總RNA，應用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。DKK1的引物為DKK1-RT-F:5'-ATAGCACCTTGGATGGGTATTCC-3'，DKK1-RTR:5'-CTGATGACCGGAGACAAACAG-3';內參 GAPDH-F:5'-CATGGGTGTGAACCATGAGAA-3'，GAPDH-R:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，嚴格按照RT-PCR試劑盒說明書操作。

1.2.4 DKK1蛋白表達檢測 采用 Western blot法。轉染后48 h，按照RIPA說明書提取蛋白，按蛋白30 μg/孔上樣。SDS-PAGE垂直電泳，轉移至NC膜。5%脫脂奶粉(溶于PBS-T緩沖液)室溫封閉1 h，兔抗DKK1一抗(1∶500)，鼠抗GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃孵育過夜。PBS-T緩沖液振蕩清洗5 min×3。室溫下加入山羊抗兔 IgG抗體(1∶10 000)或山羊抗鼠IgG抗體(1∶8 000)孵育1 h，同前法洗膜3次，ECL化學發光法顯色，X光片曝光顯影。

1.2.5 腺病毒載體構建與轉染 將篩選獲得的最佳DKK1 shRNA片段進行雙酶切、凝膠回收，通過T4 DNA連接試劑盒進行連接、轉化，及雙酶切鑒定。采用Ad EasyTMAdenoviral vector system進行重組陽性克隆的篩選pAd5-shDKK1，磷酸鈣法轉染293細胞后，通過包裝、擴增和純化，獲得重組腺病毒Ad5.shDKK1，同時構建攜帶對照shRNA的重組腺病毒Ad5.shCON。取對數生長期的SMMC-7721細胞于96孔板中，每孔1×105個細胞，分別轉染Ad5.shDKK1(轉染組)和 Ad5.shCON(空載組);每個濃度作4個復孔，同時設立PBS作為對照。

1.2.6 細胞相對增殖活力、WNT信號通路檢測 采用MTT法分別在轉染組和空載組轉染24、48、72、96 h檢測細胞相對增殖活力，嚴格按照說明書操作。參照1.2.4，采用 Western blot法檢測轉染組和空載組轉染48 h后Wnt信號通路中的β-catenin、CMyc、Cyclin D1、PCNA。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 最佳干擾片段篩選 與D組比較，A、B、C組DKK1 mRNA和蛋白的表達均有不同程度的抑制，其中作用最強的是C組，P均＜0.05。見圖1。

圖1DKK1 mRNA和蛋白表達

2.2 轉染組和空載組細胞相對增殖活力及Wnt信號通路比較 轉染組轉染后24、48、72、96 h的細胞相對增殖活力分別為133.65%±11.30%、169.41%±4.64%、251.39%±13.86%、336.70%±16.62%，空載組分別為 94.65%±1.77%、98.01%±3.28%、93.80%±2.26%、93.41%±2.22%;兩組同時間點比較，P 均 ＜0.01。轉染組 β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、PCNA 分 別 為 568.59%± 25.36%、351.26%±13.43%、295.35%±45.56%、125.35%±23.61%，空載組分別為 102.23%±4.53%、98.65%±7.89%、101.35%±9.23%、97.65%±6.87%，P 均 ＜0.05。

3 討論

HCC惡性程度極高，具有發展快、病死率高等特點，其發病機制尚不清楚。細胞增殖與凋亡失衡是腫瘤形成和發展的一個重要機制，該過程涉及多個基因的改變，并受著復雜的信號傳導網絡系統的調節［5］。DKK是在進化過程中很保守的基因家族，在脊椎動物中包括 DKK1、DKK2、DKK3和 DKK4 4個成員。DKK家族成員都是分泌型的糖蛋白，除DKK3外均可以參與調控Wnt信號通路［4］。在不同的Wnt信號途徑中，DKK僅僅特異性地影響經典Wnt信號通路，而對于Wnt/PCP通路及Wnt/Ca2+通路沒有明顯的作用［5］。DKK1是一種分泌型糖蛋白，能夠與細胞膜上的 Wnt受體 LRP5和Kremenl結合，從而形成內吞小體，阻斷 Wnt信號通路［6，7］。DKK1在胃腸癌、乳腺癌和惡性膠質瘤中表達增加［8，9］，在 HCC、食管癌、黑色素瘤等中表達明顯升高［10，11］，這種差異性表達在腫瘤中的作用尚不清楚。

腺病毒載體介導的對DKK1基因的RNA干擾有很多優點［12］，優于常規的脂質體轉染方法［13］，可獲得更高的、更穩定的轉染效果。腺病毒載體攜帶的基因效率一般更高，容易制備獲得高滴度病毒，表達的外源基因更高效;另外，腺病毒轉染多種類型的人組織細胞，從而獲得廣譜的轉基因作用。腺病毒安全性更高，不會整合到宿主細胞基因組。因此，腺病毒載體介導的RNA干擾對于研究HCC及其他腫瘤的生物學功能具有廣泛的應用前景和重要的理論和實踐意義。

Wnt信號途徑的異常激活可以啟動下游多種癌基因的轉錄，并導致正常細胞的癌變。研究發現，Wnt/β-catenin通路的激活是HCC發生的主要分子機制之一［7，14］。在腫瘤的研究中發現，WNT/β-catenin信號途徑的異常激活通常能促進腫瘤的發生，因此，鑒定引起WNT/β-catenin信號途徑異常激活的成因，檢測核心Wnt信號通路分子可為腫瘤發生、發展以及預測預后提供指導［15］。本研究結果表明，轉染組 WNT信號通路中的 β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、PCNA 和轉染后24、48、72、96 h 的細胞相對活力均高于空載組，說明在 HCC細胞系SMMC7721中下調DKK1基因的表達會引起HCC細胞的增殖，可能與激活 Wnt信號通路的表達有關。

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圖4 SMMC7721細胞轉染質粒DNA后綠色熒光蛋白表達情況