婦科門診人乳頭瘤病毒感染基因型分析＊

包常華，張東麗，劉 鑫，崔桂玉，石 凱

(內蒙古民族大學 a.醫學院;b.農學院，內蒙古 通遼市 028000)

近代臨床和分子生物學的研究已經證實人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發病的主要危險因素［1］。婦科門診中宮頸癌是嚴重危害全世界女性的一種惡性疾病，中國每年新增患者數達8.2%［2］。目前已經鑒定的HPV有200余種，其中50多種可以感染生殖道，尤其是高危型別的持續、反復感染與宮頸癌密切相關，因此，HPV病毒感染的早期診斷和早期治療對宮頸癌的預防至關重要。應用分子生物學技術手段進行病毒感染檢測的研究，正逐步發展成為婦科腫瘤預防方面的前沿學科。本研究對2013年6月至2013年12月來我研究所進行HPV感染基因型檢測的364例女性宮頸脫落細胞樣本進行分析，旨在了解本地區女性HPV感染情況和型別的分布。為進一步開展預防措施，降低該病毒的感染率，從而進一步降低本地區女性宮頸癌的發生率提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2013年6月至2013年12月來我研究所進行HPV分型檢測的婦科女性患者，共364例，年齡波動范圍為21-58歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 HPV DNA提取試劑盒、HPV21快速導流雜交試劑盒、核酸導流快速雜交儀(凱普生物技術有限公司)，PCR擴增儀(Biometra)，微量移液器(eppendorf)。

1.2.2 標本采集 我市計生醫院婦科門診就診患者以及我校病原生物學研究所進行檢查的患者進行采樣，采集人員以窺陰器暴露宮頸口，先用棉簽擦去宮頸分泌物，再將宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動宮頸刷使其順時針轉動五圈。慢慢去除宮頸刷并將其放入裝有細胞保存液的取樣管中，標記患者編號及采樣日期，4℃保存，并于一周內進行檢測。

1.2.3 DNA提取 微量移液器吸取標本500 μL于離心管中，14000 r/min離心5 min，棄去上清液;沉淀中加入溶液Ⅰ400 μL并煮沸15 min;平衡室溫后加溶液Ⅱ400 μL，14000 r/min 離心 5 min，棄去上清液;沉淀中加入溶液Ⅲ60 μL靜置10 min后14000 r/min離心1 min，溶液中即為DNA溶液。

1.2.4 PCR擴增 上述 DNA溶液1 μL加入分裝有24 μL反應液PCR管中，置PCR擴增儀中擴增。反應條件為95℃變性9 min，40個循環(94℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 延伸5 min。

1.2.5 導流雜交 運用凱普生物技術有限公司導流雜交儀進行雜交，具體操作嚴格按照試劑盒說明進行。可檢測出HPV的15種高危型別:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68;和 6種低危型別:HPV6、11、42、43、44，CP8304(81)。

2 結果

2.1 HPV感染率統計

364例標本中陽性例數62例，總陽性率為17.03%(62/364)。共檢測到HPV亞型16種，未檢出高危型別中的45、51、59型和低危型別中的43、44型。

2.2 HPV DNA亞型分布

共檢出HPV高危型別12種，所占比例為80.95%;低危型別4種，所占比例為19.05%。感染HPV患者中以HPV31、HPV18、HPV16三種亞型較為多見，所占比例分別為 13.09% 、11.90% 、10.71% ，具體統計結果見表1。

表1 病毒感染患者HPV單亞型陽性分析Tab.1 Analysis of HPV subtype of patients infected with the virus

2.3 HPV感染人群年齡分布

標本采集人群年齡波動范圍為21-58歲，其中以31-40歲年齡組感染率最高，比例為45.16%，隨著年齡增大感染率有逐漸下降的趨勢，結果見圖1所示。

圖1 HPV感染人群不同年齡組別分布結果Fig.1 The distribution of HPV infection in population of different age

2.4 HPV的單一感染和多重感染

病毒感染陽性患者中單一感染率為70.97%(44/62)。多重感染率為29.03%(18/62)，其中二重感染陽性率為22.58%(14/62)，三重感染率6.45%(4/62)，未發現四重及以上感染，結果見圖2所示。

圖2 HPV單一感染與多重感染百分率統計結果Fig.2 The results of the percentage of HPV single infection and multiple infections

3 討論

本實驗檢測方法采用基因芯片和導流雜交技術，具有靈敏、特異、簡便和快速等特點［3，4］，能準確地進行病毒基因型檢測，有效進行預后判斷和治療診斷。經過對采集的宮頸脫落細胞標本進行HPV DNA分型檢測后發現:

3.1 HPV感染常見基因型分布存在區域性差異

國際癌癥研究協會的調查中發現在宮頸癌患者感染的HPV亞型(數據中不包含中國人)中處于前五位的是 16(57.4%)、18(16.6%)、45(6.8%)、31(4.3%)、33(3.7%)［5］。本研究結果與之存在差異，本地區感染HPV亞型處于前五位的分別是31(13.09%)、18(11.90%)、16(10.71%)、6(9.52%)、52(8.33%)。364 例樣本中共檢出 HPV感染62例，總感染率為17.03%，與深圳地區的17.5%基本一致［6］，低于浙江臺州地區的35.08%、北京地區的57.10%、山西陽泉地區的35.20%以及湖北鄂州市的30.93%［7-10］。已有報道顯示在多數亞洲國家 HPV52、58 感染率高于 HPV31、33［11］，本實驗結果表明在本地區HPV52、58感染率則低于HPV31型而高于HPV33型。與我國境內的其他省市地區相比較而言，HPV感染的常見亞型存在一定的地區差異:例如浙江臺州地區常見亞型為 16、11、52、53、58型［7］，北京地區常見亞型為 16、58、52、53、33 型［8］，湖北鄂州市常見亞型為 16、58、53、42、31/6 型［9］，山西陽泉地區常見亞型為 16、52、58、11、68 型［10］。本研究中內蒙古通遼地區常見亞型為31、18、16、6、52，且處于感染亞型首位的為31型，與上述幾個調查地區有差異。有研究表明北京地區以及紹興地區的女性HPV感染基因亞型除了16、52、58型外，CP8304(81)在該地區常見［10，11］，而在本研究中CP8304(81)陽性率較低(4.76%)。低危型11型在臺州以及陽泉地區有較高的感染率，而在本地區的檢出率較低。綜上列舉數據表明HPV感染常見基因亞型分布存在明顯的人群和區域性特點。

3.2 HPV多重感染與宮頸疾病相關性

本地區以單一感染為主，所占比例為70.97%，多重感染率為29.03%，與我國其他省市地區的報道結果類似［6-11］。其中以二重感染居多，最多檢測出三重感染，未見四重及以上感染樣本。目前，關于HPV的多重感染是否會增加宮頸癌的發生還存在爭議［9］，為此還需擴大樣本量并結合臨床，以期得出更為科學客觀的結論。生殖道是HPV感染常見的部位之一，同時也是其他婦科病原微生物的寄生之處［12］。有報道表明HPV陽性婦女其它生殖道病原體的感染率高于HPV陰性婦女，細菌性陰道炎在HPV陽性婦女中普遍存在，沙眼衣原體感染也與HPV持續感染具有一定的相關性［10］，支原體可能也在病毒的持續感染中起作用［12］，細菌、病毒等的感染可以引起宮頸炎性病變，宮頸炎性病變也是誘發宮頸癌的高危因素，所以HPV的多重感染或是HPV混合其他生殖道病原微生物的感染是否促進宮頸癌癌前病變及宮頸癌的發生有待進一步研究。

流行病學和生物學研究表明，HPV是宮頸癌的重要致病因，沒有HPV的感染就不會發生宮頸癌［13］。根據HPV與宮頸癌發病風險的關系，可將其分為低危型和高危型［14］。低危型可導致生殖器尖銳濕疣，影響生活質量，高危型與宮頸癌及宮頸上皮內高度病變(CIN2/3)的發生相關，99.7%的宮頸癌患者中存在高危型HPV感染，且病毒量與宮頸病變的程度有關。包括據世衛組織相關信息和已發表文獻數據的統計結果表明，亞洲地區宮頸脫落細胞正常的女性中多見于高危型 16、18、52 的感染［15，16］。本研究中檢測所得多見亞型種類與國內外報道的多見亞型種類基本相似，但亞型的分布在我國存在著地區間的差異性，并且所檢標本中存在著30.76%的多重感染患者。因此婦女定期進行HPV的體檢具有一定的臨床應用價值，總之利用雜交的方法進行HPV的DNA分型檢測，具有特異、快速、靈敏的特點，是控制和預警宮頸癌發生的有效手段，通過該實驗了解本地區人群HPV感染情況及其DNA亞型分布，對于HPV的感染及其誘發的疾病進行早預防、早診斷、早治療均具有重要意義。

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