AtNDPK2基因轉化敖漢苜蓿及其耐鹽性分析＊

王麗娜，王麗艷，劉景文，郭永霞*，金 勛，芮海英

(1.黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江省農業科學院大慶分院，黑龍江 大慶 163319;3.大慶市農業委員會，黑龍江 大慶 163319)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是具有豐富的營養價值和強大生態功能的優質牧草，被全世界廣泛種植。然而，近年來隨著全球生態環境的日益惡化，出現的低溫﹑鹽漬﹑干旱等非生物脅迫環境，嚴重威脅紫花苜蓿的生長，限制了牧草產業化發展。黑龍江省鹽堿地總面積約占188萬公頃［1］，尤其西部地區的肇源﹑安達、大慶是重要的畜牧生產基地，也是鹽堿化較重，面積較大的區域，pH都達到了8.0以上［2］。為了保證該地域畜牧業的持續發展，還需要充分的利用和改良鹽堿地來提高牧草的生產率。現代分子生物學與基因工程技術的結合，通過向牧草中導入抗逆相關目的基因，獲得抗逆性更強的牧草新品種，對提高牧草抗逆性和產量有重要意義。

近年來，與植物抗逆性相關的基因核苷二磷酸激酶(NDPKs)在轉基因工程中備受關注，其是一種由數個16-20 kD多肽組成的70-100 kD的蛋白質，廣泛存在于原核和真核生物中［3］，它不僅作為一種“看家酶”來維持細胞NDP和NTP的代謝平衡，而且還是一組多功能蛋白酶，參與細胞的生長和分化并與信號轉導有關，參與熱脅迫響應以及H2O2介導的氧化脅迫響應等等［4-6］。植物中 NDPKs大體上分為NDPK1，NDPK2，NDPK3三種類型，其中 NDPK2與多種脅迫響應相關。研究發現轉NDPK2基因的擬南芥能夠耐受－7℃低溫脅迫1 h，離體葉片耐受1 μmol·L-1甲基紫精(MV)7 d［7］;轉 AtNDPK2 基因的馬鈴薯能夠耐受80 mmol·L-1NaCl脅迫及42℃高溫脅迫［8］。這些研究結果充分說明NDPK2的過量表達能夠通過調解氧化還原系統來提高轉基因植株對低溫、高鹽和氧化等非生物脅迫的抗性。

本研究的主要目的是將甘薯過氧化物酶啟動子(SWPA2)驅動下的AtNDPK2基因通過農桿菌介導法轉入紫花苜蓿受體系統中，建立轉化體系;利用PCR技術初步檢測出陽性植株，并對獲得的陽性轉基因植株進行鹽脅迫分析，確定該基因的轉化是否增強了苜蓿植株的耐鹽性，為后期苜蓿新種質遺傳選育奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿品種“敖漢”由黑龍江省畜牧研究所提供;含有目的基因AtNDPK2的植物表達載體pCAMBIA2300由韓國生命工學研究院郭尚珠教授惠贈(圖1-1A，1B)，可用于遺傳轉化的根癌農桿菌(Agrobacferium tumefaciens)菌株EHA105由黑龍江八一農墾大學分子實驗室建立并保存。

圖1 -1A pCAMBIA2300質粒載體圖譜Fig.1 -1A Plasmid vector map of pCAMBIA2300

1.2 農桿菌介導的轉化及再生植株的獲得

農桿菌EHA105經活化后，當菌液的OD600為0.6～0.8時，侵染經預培養3～5 d的下胚軸10～15 min后，轉接到含有50 mg·L-1乙酰丁香酮(AS)和2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT 的改良 SH 培養基上共培養2～3 d，經Cef脫菌后先轉接到僅含350 mg·L-1Cef和 2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT的改良SH培養基上進行一段時間培養后，再轉接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan以及0.1 mg·L-1KT改良的 SH培養基上誘導抗性分化芽，待抗性分化芽長至2～3 cm時隨后將其轉接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan的1/2MS培養基培養生根苗，培養14 d左右長至2～3條根后馴化移栽。

1.3 抗性植株的分子生物學鑒定

圖1 -1B 含有AtNDPK2基因的質粒載體Fig.1 -1B The vector structure with AtNDPK2 gene

利用CTAB法提取苜蓿植株葉片的基因組DNA，以AtNDPK2基因為模板設計一對特異性引物，上游:5'-CACCATGGTGGGAGCGACT-3'，下 游:5'-TCTGTCTAGACAAGGATCA-3'，進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL):DNA模板1 μL，上游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)2 μL，10 ×loading buffer 2.5 μL，Taq 酶 2.5 μL。PCR 反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸8 min，4℃終止保存。電泳及凝膠成像觀察擴增出來的目的條帶的分子量大小是否在540 bp左右。

1.4 轉基因苜蓿的耐鹽性分析

選取生長狀態良好的轉基因和非轉基因苜蓿經組織培養后，將獲得的組培苗轉接到含有0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0%NaCl的 1/2MS 的培養基中進行鹽脅迫處理，每處理重復3次(瓶)，每重復(瓶)4株，培養溫度25±2℃，光照強度2000～3000 lx，光周期時間16 h/8 h。經3周鹽脅迫后各處理分別取樣。

1.5 各生理生化指標的測定

利用氮藍四唑法［9］和愈創木酚法［10］測定超氧化物酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性，利用電導儀法［9］測定質膜透性及硫代巴比妥酸(TBA)比色法［11］測定丙二醛含量，每處理重復測定3次，取3次平均值。

2 結果與分析

2.1 轉基因苜蓿的獲得

通過農桿菌EHA105(pCAMBIA2300)介導的轉化獲得轉基因“敖漢”苜蓿23株，轉化率為23.3%。

2.2 抗性植株的PCR檢測

因AtNDPK2基因片段的擴增條件已經很明確，所以設計特異性引物進行PCR擴增，以質粒DNA為陽性對照，以非轉基因植株為陰性對照。對獲得的23株抗性植株進行PCR檢測。結果有20個株系擴增出了約530 bp左右的目的片段，轉化率為86.9%(圖2-1部分結果圖片)。初步表明AtNDPK2基因已經整合到“敖漢”苜蓿的基因組中。

2.3 鹽脅迫下苜蓿植株的生長狀況

將轉基因植株和非轉基因植株的組培苗進行擴繁后，選擇大小形態一致的再生苗進行不同濃度的鹽脅迫處理，非轉基因組培苗作為對照。發現NaCl濃度為0% ～0.4%處理中，兩者之間組培苗的大小形態沒有明顯的變化。隨著處理濃度增大，NaCl濃度為0.6%處理中，發現轉基因植株的葉片水浸狀、萎蔫數量明顯的少于對照，并頂部葉片處于平展狀態，而對照組葉片呈現水浸狀，萎蔫數量多，頂部葉片卷曲(圖2-2)。隨著鹽濃度加大和處理時間的延長對照組植株在NaCl濃度≧0.6%逐漸黃化死亡，轉基因組培苗葉片呈現水浸、萎蔫、卷曲的數量隨濃度升高而增多，在NaCl濃度達到1.0%處理中沒有死亡現象發生。由此說明了AtNDPK2基因的轉化增強了苜蓿應對高鹽濃度的耐受性，葉片受脅迫響應出現癥狀明顯。

2.4 鹽脅迫下相對電導率和丙二醛(MDA)含量變化

轉基因植株和非轉基因植株在0%～0.2%NaCl處理濃度下，細胞內電解質相對滲出率較低，兩者之間相對電導率沒有明顯的差異。隨著鹽濃度的升高非轉基因植株質膜相對電導率顯著增大，而轉基因植株相比于0% ～0.2%NaCl處理增大的幅度不明顯，表現出轉基因植株的相對電導率相比較非轉基因植株顯著降低最后趨于平穩。在非轉基因植株中丙二醛含量的變化趨勢為隨著鹽處理濃度的升高，丙二醛含量是逐漸升高的，而轉基因植株的丙二醛含量在0.2%NaCl處理下與非轉基因植株沒有顯著的差異，當鹽濃度＞0.2%時，轉基因植株相比較非轉基因植株丙二醛含量明顯降低，與非轉基因植株呈顯著性的差異，隨著鹽處理濃度的增大轉基因植株的丙二醛含量趨于平穩(圖2-3)。電解質相對電導率和丙二醛含量是衡量植物質膜完整性和膜質過氧化程度的標準，該結果表明高鹽脅迫下，轉基因植株細胞膜受傷害小，細胞膜完整性較好，膜質的過氧化程度低，植株遭受損害輕，NDPK2基因的過量表達提高了植株的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫下超氧化物酶(SOD)活性變化

轉基因植株和非轉基因植株在0%～0.2%鹽脅鹽脅迫下維持正常生理活動，提高植株耐鹽能力。

圖2-1 轉AtNDPK2植株的基因組DNA提取及PCR擴增的目的基因Fig.2-1 Genomic DNA extracted of AtNDPK2 and the target gene of PCR amplifing

圖2-2 鹽脅迫下非轉基因植株(A)，轉基因植株(B)的表現形態Fig.2-2 The performance of non-transgenic plant(A)，transgenic plant(B)under salt stress

2.6 鹽脅迫下過氧化物酶(POD)活性變化

圖2-3 鹽脅迫下植株相對電導率(%)和丙二醛含量(%)的變化Fig.2-3 The changes relative elecrtrical conductivity(%)and MDA(%)of plant under salt stress

非轉基因與轉基因植株在不同的鹽濃度下POD的活性變化各不相同，當NaCl濃度達到0.4%時非轉基因植株的POD活性達到最大值，隨著鹽濃度的不斷增加，非轉基因植株POD活性不斷下降;而轉基因植株的POD活性一直維持在較高水平。POD也是一種植物細胞內的保護性酶，不僅與植物抵御不良環境條件有關，而且它還與植物抵御各種病害和環境中某些營養元素脅迫以及植物抗衰老有關。大部分試驗證明，POD活性越高，植株的抗逆性越強。該迫條件下超氧化物酶(SOD)的活性都沒有發生明顯的變化，當鹽處理濃度≥0.4%的時，兩者的SOD酶活性顯著增高。隨鹽濃度的增加，非轉基因植株SOD活性呈現出降低的趨勢，當NaCl濃度為1.0%時SOD酶活性最低;而轉基因植株SOD活性則呈現出不斷升高，SOD活性顯著的高于非轉基因植株，并隨鹽濃度增大而趨于平穩(圖2-4)。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內重要的保護酶，能夠有效清除因脅迫或損傷造成的細胞產生大量自由基或過氧化物，使它們維持較低水平，避免細胞結構受到危害。該結果說明了SOD活性越高越有利于轉基因植株在結果說明了POD酶活性越高，植株細胞損傷程度越小，從而提高了苜蓿的耐鹽性。

3 討論

近年來，對于紫花苜蓿植株的遺傳轉化研究比較廣泛，轉化的基因類型主要包括品質改良，抗病、蟲害，抗除草劑，抗逆相關基因以及作為生物反應器等［12］。其中對于抗逆基因的轉化研究比較深入。大多數研究結果表明植株的抗逆性往往是受多基因控制的，單一功能基因的導入，并不能達到預期的效果。本實驗選用甘薯過氧化物酶啟動子(SWPA2)，SWPA2是一種較強的脅迫誘導型啟動子，更加適用于培育耐環境脅迫的轉基因植物研究［13，14］。NDPK2又是一種促進多種抗氧化酶表達的抗逆基因［15］。兩者組合達到了提高抗逆性的雙重功效，這將對增強苜蓿轉基因植株的耐鹽性具有重要意義。

圖2-4 鹽脅迫下植株超氧化物酶(SOD)活性變化Fig.2-4 The changes SOD activity of plant under salt stress

圖2-5 鹽脅迫下植株過氧化物酶(POD)活性變化Fig.2-5 The changes POD activity of plant under salt stress

基因的轉化是否增強了植株的耐鹽性，需要對轉基因植株進行了耐鹽性驗證。研究結果顯示當轉基因植株受到0.4% ～1.0%NaCl脅迫時，SOD、POD活性上升，非轉基因植株的SOD、POD也在逐漸上升只是兩者的活性表現上升幅度不同，轉基因植株酶活性始終高于非轉基因植株。當NaCl濃度0.6%脅迫7 d時發現非轉基因植株出現了葉片呈現水浸、卷曲、萎蔫癥狀，而轉基因植株表現不明顯。SOD，POD是清除活性氧自由基的關鍵酶［16，17］，在氧化脅迫反應早期起主要調節作用［18］，所以該生理生化指標可用來衡量植株的耐鹽性。轉基因植株與非轉基因植株質膜相對電導率及丙二醛含量也表現出顯著性差異，隨著鹽濃度的增加，發現轉基因植株的相對電導率及丙二醛含量明顯低于非轉基因植株，而非轉基因植株相對電導率及丙二醛含量呈現上升趨勢。相對電導率變化可反映質膜的破壞程度及植株的抗逆性強弱［19-21］，丙二醛含量變化也可反映植物遭受逆境傷害的程度［22］。該試驗獲得的結果充分說明在高濃度鹽脅迫下，轉基因株系膜脂質過氧化程度低，膜結構受到的傷害較小，質膜的選擇透性強，植株受損程度小，進一步證實了AtNDPK2基因的轉入提高了轉基因“敖漢”苜蓿的耐鹽性。農桿菌EHA105菌株介導轉化SWPA2啟動子驅動的AtNDPK2基因增強了“敖漢”苜蓿植株的耐鹽性。

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