小麥高分子量麥谷蛋白亞基基因Dx5的克隆與生物信息學分析＊

黃明亮，黃志剛，徐穎瑩，劉 清，唐 蛟，李合松

(湖南農業大學植物激素與生長發育湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

小麥是世界上重要的糧食作物。小麥籽粒中蛋白質的含量和質量是影響小麥品質的關鍵因素，直接關系到面團的特性和面包加工品質［1］。小麥籽粒蛋白質主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，其中后兩種蛋白合稱為貯藏蛋白，是面筋的主要成分，約占籽粒蛋白質的85%［2-4］。

根據分子量的大小，麥谷蛋白可分為高分子量麥谷蛋白亞基 (HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基 (LMW-GS)，其中HMW-GS約占小麥籽粒蛋白質總量的12%，其組成和質量直接影響小麥面粉的品質［5］。

HMW-GS中以5和10亞基對面粉的品質影響最大［6］，其兩者的編碼基因Dx5和Dy10共同存在及連鎖表達對提高生面彈性和面包的烘烤質量尤為明顯［7］，但傳統的雜交育種手段難以同時獲得Dx5與Dy10重組基因且穩定表達的小麥后代。然而采用遺傳轉化分子育種手段獲得Dx5與Dy10基因表達的新型小麥種質資源已有成功的先例，如Altpeter等［8］將小麥HMW-GS的Dx5和Dy10基因轉化燕麥，獲得了總蛋白質含量、麥谷蛋白含量和聚合狀麥谷蛋白含量顯著增加的轉基因材料。

濟麥20是山東省農業科學院作物所培育的面包面條兼用型優質小麥品種［9］，其籽粒蛋白質含量高，經農業部谷物品質監督檢驗測試中心測定為17.02%(干基)。濟麥20的HMW-GS為1、7+8和5+10優質亞基組合［10］，其中5+10亞基由 Glu-D1位點的Dx5和Dy10所編碼［11］。本研究以優質小麥品種濟麥20為材料，克隆HWM-GS基因Dx5，并對其序列及編碼的蛋白質進行生物信息學分析，旨在為進一步采用遺傳轉化分子育種手段來獲得Dx5和Dy10基因高表達的新型小麥種質資源和深入研究HMW-GS基因的表達調控機理及開展作物蛋白質品質的改良奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗所用濟麥20的種子由河南大學尚富德教授提供。種子經催芽后置于人工氣候箱中，25℃恒溫培養15 d后用于提取基因組DNA。大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、凝膠回收試劑盒和pMD19-T載體試劑盒等購自TaKaRa公司。引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA提取及 PCR擴增 采用CTAB法進行基因組 DNA提取［12］。PCR擴增引物為P1F:TATCATCACCCACAACACC和P1R:GCATGCCTAAGCACCAT;PCR反應體系:50 μL體系中包括1.25 U 的 Taq DNA 聚合酶，0.2 mmol·L-1的dNTP，引物各 50 μmol·L-1，模板 DNA 200 ～ 300 ng;PCR條件:94℃預變性5 min，然后以94℃變性30 s，50℃退火30 s和72℃延伸3 min進行30個循環，最后以72℃延伸5 min結束;擴增產物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1.2.2 PCR產物的TA克隆與序列測定 PCR產物的凝膠回收按照說明書進行。連接反應按pMD19-T載體試劑盒說明書進行，利用熱激法將連接后的載體轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。轉化后的大腸桿菌經氨芐青霉素、X-Gal和IPTG平板篩選，挑取白色菌斑進行菌體PCR擴增鑒定，選取PCR呈陽性的單菌落測序。測序工作由北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司完成。

1.2.3 生物信息學分析 開放閱讀框的預測采用ORF Finder;數據庫的檢索在GenBank中進行;采用Blast程序進行相似性分析;序列的基本分析采用DNAStar 7.1程序包進行;進化樹分析采用 MEGA 5.10;進化樹的查看采用Treeview 32。

2 結果

2.1 Dx5 基因的克隆

圖1 Dx5基因的克隆Fig.1 Cloning of Dx5 gene

PCR擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到一條長約2600 bp的DNA片段 (圖1)，該片段長度與預期相符。回收PCR擴增產物，與pMD19-T載體連接后轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取經菌落PCR鑒定為陽性的單菌落送給華大基因公司測序。

圖2 JMDx5基因序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 The sequences and amino acid sequences of JMDx5 gene

2.2 測序結果與分析

測序結果經拼接后得到長度為2619 bp的序列。利用在線預測工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行分析發現，該序列的最大開放閱讀框是+3框，長度為2520 bp(從63 bp到2582 bp)，共編碼839個氨基酸殘基 (圖2)。Blast分析結果顯示，按照+3框翻譯的氨基酸序列在GenBank數據庫中才能找到相似性高且完整的氨基酸序列，與Triticum aestivum x Secale cereale高分子量麥谷蛋白亞基(Sequence ID:gb|AGS18765.1|)的一致性 (Identities)達到99%(835/839)，且具有高分子量麥谷蛋白亞基結構域 (圖3)，表明克隆獲得的序列為Dx5基因，將其命名為JMDx5。

2.3 JMDx5的系統進化分析

利用BlastP對JMDx5序列進行蛋白質同源性搜索，去除序列的冗余，篩選JMDx5的同源蛋白質并下載，利用MEGA 5.10軟件進行系統進化分析。采用Neighbor-Joining(NJ)方法構建的進化樹 (圖4)表明，Dx5蛋白質通過進化可能分為兩大支，JMDx5在進化上具有保守性;JMDx5與斯卑爾脫小麥 (Triticum spelta)、普通小麥(Triticum aestivum)及普通小麥與黑麥的雜交后代 (Triticum aestivum x Secale cereale)的Dx5進化距離近，與長穗偃麥草 (Lophopyrum elongatum)和山羊草(Aegilops sharonensis)等的進化距離較遠。

2.4 JMDx5二級結構的預測分析

登錄網址 (https://www.predictprotein.org/)，將JMDx5蛋白質序列輸入，對其進行二級結構預測。由圖5分析可知JMDx5二級結構可能呈單一環狀，沒有螺旋和折疊結構，而且暴露在外和埋藏在內的氨基酸殘基數目比較接近。

圖3 JMDx5蛋白質保守結構域Fig.3 The conserved domains of JMDx5 protein

圖4 JMDx5蛋白質系統進化樹Fig.4 The phylogenetic of JMDx5 protein

圖5 JMDx5蛋白質二級結構預測圖Fig.5 JMDx5 protein secondary structure prediction chart

2.5 JMDx5蛋白質理化性質分析

利用在線軟件 ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對JMDx5蛋白質進行理化性質預測分析，結果顯示，氨基酸分子式為C3833H5794N1190O1294S7，分子量為 8.93576 KD，等電點 pI為 6.10。穩定系數計算結果為85.02，為不穩定的蛋白質。

3 討論

HMW-GS的組成和質量是影響小麥面粉品質的重要因子。HMW-GS中以5和10亞基對面粉的品質影響最大［6］，其中5亞基由1D染色體上 Glu-D1位點的Dx5基因所編碼，其編碼區無內含子，3'端有PolyA信號［13］。本研究采用蛋白質含量高的優質小麥品種濟麥20，基于Blast檢索和生物信息學分析，設計特異引物，直接以基因組DNA為模板，克隆獲得了長度為2619 bp的序列，該序列與GenBank數據庫中的Dx5蛋白質一致性達到99%，且具有HMW-GS結構域，將其命名為 JMDx5基因并提交GenBank數據，登錄號為KJ144185。來源于優質小麥品種濟麥20的JMDx5基因序列與已報道的Dx5基因的序列差異很小，因此，可以作為目的基因，通過轉基因方法探索其在改良作物蛋白質品質的用途。

生物信息學分析表明，JMDx5基因編碼含839個氨基酸殘基的多肽鏈，分子量約為8.94 KD，等電點pI為6.10;JMDx5二級結構可能呈單一環狀，沒有螺旋和折疊結構，推測與其作為貯藏蛋白的功能有關;系統進化分析發現，除去小麥屬植物，JMDx5與節節麥(Aegilops tauschii)的Dx5進化距離較近，這為探究濟麥20品種與其它物種的進化關系提供了依據。JMDx5基因的成功克隆及生物信息學分析，為JMDx5基因表達調控機理及其與小麥蛋白質品質關系的研究打下了基礎。

［1］唐建衛，劉建軍，張平平，等.濟麥20面團流變學特性和面包加工品質穩定性及與蛋白質組分的關系分析［J］.作物學報，2007，33(11):1788-1793.TANG Jianwei，LIU Jianjun，ZHANG Pingping，et al.Dough properties and loaf quality stability in wheat cultivar jimai 20 and their relationship with protein fractions［J］.Acta Agronomica Sinica，2007，33(11):1788-1793.

［2］趙新，王步軍.小麥蛋白質和淀粉性狀與面包品質關系研究進展［J］.中國農學通報，2008，24(12):124-127.ZHAO Xin，WANG Bujun.Advances in relationship of bread quality and characteristics of protein and starch of wheat［J］.Chinese AgriculturalScienceBulletin， 2008， 24(12):124-127.

［3］劉麗，楊金華，胡銀星，等.麥谷蛋白亞基與小麥品質的關系研究進展［J］.中國農業科技導報，2012，14(1):33-42.LIU Li，YANG Jinhua，HU Yinxing，et al.Research progress in effects of glutenin subunits on wheat processing quality［J］.Journal of Agricultural Science and Technology，2012，14(1):33-42.

［4］周青文，萬平，陳佩度，等.麥胚乳貯藏蛋白組分遺傳研究進展［J］.麥類作物學報，2000，20(2):78-83.ZHOU Qingwen，WANG Ping，CHEN Peidu，et al.Progress in genetic research of wheat endosperm-end storage protein［J］.Journal of Triticeae Crops，2000，20(2):78-83.

［5］SHEWRY P R，HALFORD L G.Cereal seed storage proteins:structures，properties and role in grain utilization［J］.Journal of Experimental Botany，2002，53:947-958.

［6］GUPTA R B，PAUL J G，CORNISH G B，et al.Allelic variation at Glutenin subunit and gliadin loci，Glu-1，Glu-3 and Gli-1 of common wheats I.Its additive and interaction effects on dough properties［J］.Journal of Cereal Science，1994，19:9-l8.

［7］JOHANNES H，MOONEN E，ANTON C Z.SDS-PAGE of the high molecular weight subunits of wheat glutenin and the characterization of IR(IB)substitution and 1BL/IRS translocation lines［J］.Euphytica，1984，33:3-8.

［8］ALTPETER F，POPELKA J C，WIESER H.Stable expression of 1Dx5 and 1Dy10 high molecular weight glutenin subunit gene in transgenic rye drastically increases the polymeric glutelin fraction in rye flour［J］.Plant Molecular Biology，2004，54:783-792.

［9］李玉閣，邢冉冉，李黎，等.濟麥20α醇溶蛋白基因的克隆與序列分析［J］.麥類作物學報，2013，05:862-868.LI Yuge，XING Ranran，LI Li，et al.Cloning and sequence analysis of Jimai 20 alpha gliadin gene［J］.Journal of Triticeae Crops，2013，05:862-868.

［10］張維瑞，紀利坤，袁王俊，等.黃淮麥區小麥新品種(系)高分子量谷蛋白亞基組成分析［J］.河南農業大學學報，2008，01:6-10.ZHANG Weirui，JI Likun，YUAN Wangjun，et al.Analysis on components of hmw-gs in new wheat cultivars(lines)in huanghuai wheat zone［J］.Journal of Henan Agricultural University，2008，01:6-10.

［11］PAYNE P I.Genetics of wheat storage protein and the effect of allelic variation in read-making quality［J］.Annual Review of Plant Physiology，1987，38:141-153.

［12］YAN Z H，WAN Y F，LIU K F，et al.Identification of a novel HMW glutenin subunit and comparison of its amino acid sequence with those of homologous subunits［J］.Chinese Science Bulletin，2002，47(3):220-225.

［13］HALFORD N G，FORD J，ANDERSON O D，et al.The nucleotide and deduced amino acid sequences of a HMW glutenin subunit gene from chromosome IB of bread wheat(Triticum aestivum L.)and comparison with those of genes from chromosome lA and 1D［J］.Theoretical and Applied Genetics，1987，75:117-126.