利用雙光子顯微鏡檢測活體動物腦內Ca2+動態變化＊

劉雙雙，廖美華，尹 偉，林趙肖楠，肖桂鳳*

(1.浙江大學醫學院公共技術成像平臺，浙江杭州 310058;2.浙江大學毒理與生化藥學研究所，浙江 杭州 310058)

神經系統中所有的感覺和行為在細胞內被編碼，通過一系列的神經網路，將信息傳遞到更高的相關聯腦區，在這些腦區內進行信號整合后產生相應的行為。作為細胞內非常普遍的Ca2+信號傳遞系統，它控制著神經元-神經膠質細胞之間信息傳遞的許多方面，測量Ca2+信號的動態變化及傳遞方式，對于研究神經系統內信號轉導和功能調節具有重要意義［1］。

目前測量細胞內Ca2+的主要方法有電測量法和光測量法，電測量法是利用細胞膜片鉗技術測定Ca2+電流引起的細胞膜電位的變化，膜片鉗技術只能在體外培養的細胞或者腦片上進行測量［2］;光測量法是通過細胞特異性結合Ca2+熒光探針，利用共聚焦顯微鏡技術測定熒光強度的變化，但是共聚焦顯微鏡由于探測針孔的存在，使得成像深度只有80μm，無法實現活體腦內 Ca2+信號的研究［3］。因此，通過膜片鉗或者共聚焦顯微鏡技術檢測Ca2+信號，只能在細胞或者在腦切片上進行，無法深入到活體腦內部進行觀察，精確檢測活體動物腦內部Ca2+動態變化一直是科學研究中的瓶頸。雙光子顯微鏡成像是近年來出現的新技術，具有穿透性強，光漂白光毒性小等特點，它比共聚焦顯微鏡技術更適合用來觀察厚標本或活體組織內部結構和離子信號的變化［4］。本研究運用雙光子顯微鏡和Ca2+熒光染料負載技術測定活體動物腦內單個細胞內Ca2+分布影像和動作電位引起的Ca2+瞬變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

主要試劑:低熔點瓊脂糖，人工腦脊液(mmol:125 NaCl，4.5 KCl，10 glucose，26 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，2 CaCl2，1 MgSO4)，70% 消毒酒精，3% 水合氯醛，生理鹽水，雙氧水(上海生工)，二甲基亞砜(DMSO)， Pluronic F-127， Sulforhodamine 101(SR101)。Oregon Green 488 BAPTA-1(OGB-1)，SPS(mmol:150 NaCl，2.5 KCl，10 HEPES)。

實驗動物和設備:1月齡健康、清潔級BALB/c小鼠，體重18-20克(購自浙江大學實驗動物中心)。正置共聚焦雙光子顯微鏡(顯微鏡型號:Olymupus BX61W，四通道多光子熒光探測器，25x超級消復色差物鏡，FV1000驅動軟件)，MaiTai飛秒激光器(波長690-1020 nm連續可調)，腦立體定位儀，長柄鐵塊和腦固定鐵圈(圖1)，蓋玻片，眼科彎鑷，牙科電鉆，玻璃電極絲，顯微操作儀。

圖1 腦固定器械:長柄鐵塊和腦固定圈Fig.1 Brain fixation devices:long handle iron and brain retainer ring

1.2 小鼠大腦顱骨開窗手術

1.2.1 動物麻醉 選取合適年齡的BALB/c小鼠(18-20 g)，腹腔注射3%水合氯醛，注射劑量為1.35-1.4mL/100 g。

1.2.2 開顱前準備 將麻醉的老鼠用剃須刀剃去腦表面的毛發，眼科剪刀剪去頭皮，用蘸有雙氧水的棉簽擦拭腦表面以除去表面的筋膜，然后用蘸取人工腦脊液的棉簽擦拭頭骨以保持濕潤。

1.2.3 顱骨開窗手術 將麻醉的小鼠用腦立體定位儀進行固定，用牙科電鉆小心的打磨待觀察區域的顱骨，打磨區域大約為6 mm×6 mm的圓孔，待顱骨邊緣呈半透明狀態后，用鑷子輕輕按壓顱骨，觀察到邊緣軟化即可停止，用眼科彎鑷小心地夾取顱骨邊緣將其輕輕地掀掉，此過程要求動作輕微，盡量避免出血，以免影響成像，并用人工腦脊液多次清洗窗口［5］。

1.3 染料的負載

將OGB-1溶于20%F-127-DMSO中(如2 g F-127溶于10mL DMSO)配成濃度為10 mmol/L的溶液［6］，SR101溶于 SPS中配成濃度為4 mmol/L的溶液，然 后 按 照 0.25μL OGB，0.25μL SR101 和4.50μL SPS 配成染料［7］。利用顯微操作儀以 45°角緩慢注射到腦內，注射頻率為次/2 min，每次注射量在0.05-1μL之間，采用多點注射，選擇的注射點盡量避開血管，以減少出血，待注射完成1 h后進行觀察［8］。

1.4 開窗區的密封和固定

將濃度為1.5%的瓊脂糖(溫度涼至室溫)滴到開窗區腦表面，上面蓋0.17 mm蓋玻片(直徑為8 mm×8 mm)，以抑制呼吸節律對成像產生的影響，用牙科水泥將腦固定圈封在蓋玻片外圍，確保開窗區處在中央，最后將腦固定圈固定到長柄鐵塊上，使成像時老鼠大腦始終處于水平狀態。

1.5 雙光子顯微鏡觀察

利用Olympus正置雙光子顯微鏡裝置，配有長工作距離的雙光子專用物鏡-25xW(NA:1.05)進行成像，激發波長選用860 nm，發射的熒光通過外置探測器接收，利用雙色鏡(DM560)結合帶寬濾色片(575-640)檢測標有SR101的星型膠質細胞，利用雙色鏡(DM485)結合帶寬濾色片(495-540)觀察Ca2+信號。XY二維掃描時，掃描速度為2 μs/pix，圖像大小為512×512個像素;ROI時間序列掃描時，掃描速度為2 μs/pix，圖像大小為215×215個像素，連續掃描15 min，檢測Ca2+動態變化。

1.6 圖像記錄和數據處理

利用FV1000驅動軟件獲取圖像，利用 Metamorph圖像處理軟件對鈣變化水平進行測量。鈣瞬變量化用△F/F0表示，其中△F為標準熒光強度的凈變化，F0為圖像背景值。

2 結果

2.1 雙光子成像系統的組成和成像流程

雙光子顯微鏡系統主要由飛秒激光器、掃描器、物鏡、探測器、數據采集系統組成。成像流程為:鈦-藍寶石輸出脈沖激光，經過反射鏡反射后，到達擴束鏡，擴束鏡使光斑擴大，降低單位面積的能量，激光束被調整為強度分布均勻的平行光束，光束到達掃描振鏡(掃描振鏡分為X方向和Y方向振鏡，通過兩個方向振鏡的振動控制激光光斑在樣品焦平面上移動)，透過二色鏡，經過物鏡匯聚到樣品上，樣品被激發后發出熒光，經二色鏡反射到達探測器，信號被數據采集系統收集，形成圖像［9］(圖2A)。小鼠顱骨開窗后，用牙科水泥將腦固定圈固定在開窗區外的顱骨上(圖2B)，帶有固定圈和長柄鐵塊的動物樣本放置在雙光子顯微鏡下進行觀察(圖2C)。

2.2 雙光子顯微鏡觀察腦內鈣成像

負載熒光染料1 h后，將小鼠放置在雙光子顯微鏡載物臺上，顯微鏡目鏡下確定染料負載區域，調節焦平面選取帶有熒光標記的細胞密集區，主要集中在腦表面以下200-250μm處，進行雙光子掃描成像。被OGB-1標記的神經元和星型膠質細胞發出綠色熒光，被SR101標記的星型膠質細胞發出紅色熒光;熒光合成圖像中顯示黃色的為星型膠質細胞，顯示綠色的為神經元(圖3)，由圖像可見:神經元豐富且胞體清晰，圖像分辨率高，根據發射的熒光不同，能明顯區分神經元和星型膠質細胞。

圖2 在體雙光子成像系統示意圖Fig.2 Schematic diagram of In vivo two photon imaging

圖3 活體腦內神經元和星型膠質細胞鈣成像Fig.3 In vivo Ca2+imaging in Neuron and Astrocyte

2.3 神經元和星型膠質細胞內Ca2+動態變化

為了捕捉到Ca2+的快速變化，通過 ROI時間序列掃描實時檢測15 min內Ca2+動態變化，掃描速度設置為2 μs/pix，圖像大小為256×256個像素，通過圖像處理軟件Metamorph將熒光強度的變化轉化成波形圖。神經元內鈣離子通過動作電位引起自發Ca2+瞬變，通過測量神經元胞體平均像素強度量化熒光信號，神經元出現的每一個波峰代表一次鈣瞬變，即動作電位。星型膠質細胞Ca2+波形時程較長，幅度較緩，無快速上升相出現(圖4)。

3 討論

圖4 活體小鼠皮層神經元和星型膠質細胞內Ca2+瞬變Fig.4 Ca2+transents in cortical neuron and astrocyte of an mouse

雙光子顯微鏡又稱非線性、多光子激光掃描顯微鏡，是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。其基本原理是:在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的［10］。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達到80至100兆赫，使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度最高，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。雙光子顯微鏡具有以下優勢:1)長波長的光比短波長的光受散射影響較小更易穿透標本;2)焦平面外的熒光分子不被激發使較多的激發光可以到達焦平面，使激發光可以穿透更深的標本;3)長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小;4)使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性［11］。利用雙光子顯微鏡對活體動物體內Ca2+信號檢測，為神經元-膠質環路研究提供了新的技術方法。

與共聚焦顯微鏡具備多種類型激光器不同，雙光子顯微鏡配備單一的飛秒激光器，在進行多色成像時，多種染料利用同一波長的激發光激發，容易產生串色現象，為了減少OGB-1和SR101這兩種染料的相互串色，在不改變激光能量和探測器電壓值的前提下，將脈沖激光從700 nm～900 nm連續測試，波段測試步徑為10 nm，探索合適的雙光子激發波長，通過實驗發現在860 nm處既能有效激發出兩種染料的熒光，又能減少串色。

本實驗采用高親和性染料對小鼠腦內Ca2+進行雙光子成像觀察，OGB-1為Ca2+熒光指示劑，為膜通透性染料，進入細胞后，被酯酶水解，變成膜不通透性，滯留在細胞內，雙光子成像時熒光強度的變化能反應Ca2+信號的強弱［12］。SR101為星型膠質細胞特異性標記物，將兩種試劑按照合適的比例混合后，利用多小區丸劑加載技術(multi-cell bolus loading technique)負載到腦內，根據發射的熒光波長不同，可區分神經元和星型膠質細胞［8］。

為了得到高分辨率的圖像，記錄神經元快速的放電活動，實驗過程需注意以下幾點:(1)樣本制作過程中，要求動作細致，盡量避免出血，特別在用電鉆打磨顱骨過程中，待顱骨邊緣磨薄后，用鑷子輕輕掀起顱骨，若有出血現象會降低圖像信噪比，影響成像效果。(2)染料配制過程中，為了防止染料沉淀物堵塞玻璃電極絲，需要用0.45μm過濾器對染料進行過濾。(3)Ca2+染料負載時，控制負載深度在200μm-300μm處，既能標記較多神經元又可獲取高質量的圖像，染料如負載過深，由于光散射的影響，探測到的Ca2+信號較弱，如負載過淺，由于大腦表層以膠質細胞為主，則標記的神經元數量較少。(4)通過ROI方式進行時間序列掃描時，應控制ROI區域大小，使獲得每楨圖像的時間在200 ms內，以捕捉到Ca2+信號快速變化。

［1］GOBEL W，HELMCHEN F.In vivo calcium imaging of neural network function［J］.Physiology，2007，22(6):358-365.

［2］MEYERS D E，BARKER J L.Whole-cell patch-clamp analysis of voltage-dependent calcium conductances in cultured embryonic rat hippocampal neurons［J］.J Neurophysiol，1989，61(3):467-477.

［3］SAINO T，MATSUURA M，SATOH Y.Application of real-time confocal microscopy to intracellular calcium ion dynamics in rat arterioles［J］.Histochem Cell Biol，2002，117(4):295-305.

［4］STOSIEK C，GARASCHUK O，HOLTHOFF K，et al.In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(12):7319-7324.

［5］GOLSHANI P，PORTERA-CAILLIAU C.In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice［J］.J Vis Exp，2008，13(13):681

［6］HENDEL T，MANK M，SCHNELL B，et al.Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro［J］.J Neurosci，2008，28(29):7399-7411.

［7］NIMMERJAHN A，KIRCHHOFF F，KERR J N，et al.Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex In vivo［J］.Nat Methods，2004，1(1):31-37.

［8］GARASCHUK O，MILOS R I，KONNERTH A.Targeted bulkloading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo［J］.Nat Protoc，2006，1(1):380-386.

［9］ZIPFEL W R，WILLIAMS R M，WEBB W W.Nonlinear magic:multiphoton microscopy in the biosciences［J］.Nat Biotechnol，2003，21(11):1369-1377.

［10］HELMCHEN F，DENK W.Deep tissue two-photon microscopy［J］.Nat Methods，2005，2(12):932-940.

［11］DENK W，STRICKLER J H，WEBB W W.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy［J］.Science，1990，248(4951):73-76.

［12］ROCHEFORT N L，JIA H，KONNERTH A.Calcium imaging in the living brain:prospects for molecular medicine［J］.Trends Mol Med，2008，14(9):389-399.