丹參酮ⅡA磺酸鈉降解產物的分離純化及其結構鑒定

琚姝+洪勇+黃臻輝

摘 要 丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）原料水溶液經加熱降解，采用制備高效液相色譜法對其有關物質進行分離純化，獲得兩個HPLC純度大于95%的組分A （99.0 mg）和B（95.0 mg）。經MS和NMR結構解析，確證為1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉和1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉。本工作為STS原料和制劑的質量控制和穩定性研究提供有關物質對照品，以保證其質量可控。

關鍵詞 丹參酮ⅡA磺酸鈉 分離純化 結構鑒定

中圖分類號：R284.1； TQ460.7 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2014）11-0054-04

Isolation and structure characterization of the

degradated products of sodium tanshinoneⅡA sulfonate*

JU Shu**， HONG Yong， Huang Zhenhui***

（Shanghai No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co. LTD.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Two related substance A （99.0 mg） and B （95.0 mg） with HPLC purity over 95% were collected by heat degradation of the solution of sodium tanshinoneⅡA sulfonate （STS） followed by isolation and purification with the reversed phase preparative high performance liquid chromatography （Pre-HPLC）. They were finally identified as sodium 1-hydroxyltanshinoneⅡA sulfonate and sodium 1，2-dehydrotanshinoneⅡA sulfonate by analysis of MS and NMR. These two related substances verified can be used as references for the quality control and stability study of STS materials and preparations..

KEY WORDS sodium tanshinoneⅡA sulfonate； isolation； structure characterization

丹參酮ⅡA磺酸鈉（sodium tanshinoneⅡA sulfo-nate， STS），為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhza）中分離的脂溶性二萜醌類化合物丹參酮ⅡA經磺化而得到的水溶性磺酸鹽。由于其具有抗氧化活性，抗缺氧，減少血栓形成[1]，能夠降低缺血再灌注所產生的心肌線粒體脂質體過氧化物的含量、改善心肌線粒體膜的流動性、促進側支循環建立、改善心臟代謝及有效增加冠狀動脈流量，對冠心病心絞痛及胸悶等有顯著療效[2-6]；還具有抗菌消炎、治療肝病、腎病等方面的作用[7-8]；其注射劑已在臨床上廣泛使用?，F代藥學研究表明，丹參中化學成分復雜，主要為水溶性丹參酚酸類和脂溶性二萜醌類丹參酮類化合物。丹參酮類化合物主要含有丹參酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB、異丹參酮Ⅰ、ⅡA、隱丹參酮、異隱丹參酮、甲基丹參酮、羥基丹參酮等[9]，其化學結構復雜且相近，化學全合成難度大，常規的分離純化技術難以得到單一的組分，但隨著制備液相分離技術的發展，使獲得單體組分成為可能。

丁小軍[10]采用反相和凝膠色譜法分離純化STS原料粗品，得到了10 mg 1，2-脫氫丹參酮IIA磺酸鈉；Zou等[11]采用重結晶和制備色譜純化STS原料，得到了1，2-脫氫丹參酮IIA磺酸鈉和紫丹參甲素磺酸鈉的混合物；Wang等[12]采用重結晶和制備色譜純化STS原料，從50 g STS原料得到15 mg 1 -羥基丹參酮IIA磺酸鈉、12 mg 1，2-脫氫丹參酮IIA磺酸鈉；秦引林[13-14]采用制備硅膠板從10支STS水針制劑中分離得到10 mg 1-羥基丹參酮IIA磺酸鈉，采用醋酸和鉻酸部分氧化STS法定向合成出1-羥基丹參酮IIA磺酸鈉200 mg。但從STS原料藥或水針制劑中提取有關物質，由于其含量通常只有千分之幾，不易獲得。

STS原料和制劑在制備、儲存過程中因pH、光照、溫度和氧化等環境因素而導致降解，會出現酸性增強、含量降低等現象。隨著藥品質量標準提高，ICH指導原則要求盡可能提供大于0.1%的所有有關物質結構，并闡述可能產生的機制、構效關系和藥理、毒理數據等。因此，有必要規?；苽銼TS原料有關物質。本研究為了反映STS藥物真實的穩定性，綜合現有技術、方法，采用高溫破壞試驗強制降解高純度的STS原料，運用制備色譜分離純化其降解產物，推測其可能的降解途徑，以更加安全簡便的方法為產品工藝設計、質量控制和穩定性研究提供有關物質對照品，保證安全性和質量。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Varian SD-1制備液相儀及色譜柱裝填系統、色譜柱L&L4001（2.5 cm×25 cm）和L&L4002（5 cm×25 cm）、色譜散裝填料PLRP-S（10 ?m，10 nm，美國Varian公司）；色譜散裝填料ODS-AQ（5 ?m，12 nm，日本YMC公司）；Waters 2695/2489高效液相色譜儀（美國waters公司），Waters micromass ZQ單重四級桿質譜儀（美國Waters公司）；Agilent Extend C18分析柱（4.6 mm×150 mm， 5 ?m，美國Agilent公司）；冷凍干燥機（上海東富龍科技股份有限責任公司）；400 M核磁共振波譜儀（NMR AvanceⅢ 400 MHz，瑞士Bruker公司）。

STS原料和純化水（上海第一生化藥業有限公司）；甲醇和三乙胺（TEA，色譜純，美國Tedia公司）；其他常規試劑為國產分析純。

1.2 STS原料處理

取STS 10.1 g，配制成10 g/L水溶液，取 1 L 溶液置于燒瓶中 于100 ℃ 加熱回流22 h，熱降解產物溶液經三層濾紙過濾除去析出的固體沉淀，用0.45 ?m纖維素微孔濾膜進行過濾澄清，濾液經制備液相分離、純化。

1.3 色譜條件

1.3.1 分析型HPLC條件

流動相：A為0.1%TEA水溶液，B為0.1%TEA甲醇溶液。以流動相A與B按照下述體積比進行線性梯度洗脫：0 min：90%A+10%B→5 min：80%A+20%B→10 min：65%A+35%B→25 min：50%A+50%B→30 min：90%A+10%B。柱溫25 ℃，流速為1 ml/min，檢測波長為271 nm，進樣量20 ?l。

1.3.2 制備型HPLC純化條件

濾液加10%甲醇后上樣1 L，流速為100 ml/min，以流動相A與B按照下述體積比進行線性梯度洗脫：0 min：80%A+20%B→10 min：80%A+20%B→70 min：20%A+80%B，其余條件同 1.3.1。根據紫外檢測結果按峰收集樣品，對富集得到的組分A和B，用純水稀釋1倍后用相同條件再進行純化，根據紫外檢測結果按峰收集樣品，得到組分A和B的純化液。

1.3.3 制備型HPLC精制條件

對純化得到的組分A和B純化液用純水稀釋1倍后上樣500 ml，流速為25 ml/min，以流動相A與B按照下述體積比進行線性梯度洗脫：0 min：80%A+20%B→10 min：80%A+20%B→50 min：40%A+60%B，其余條件同 1.3.1。根據紫外檢測結果按峰收集樣品，對收集組分沒達到目標純度的樣品進行再次精制純化，直至得到STS降解產物組分A和B的精制純品。

2 結果與討論

2.1 STS降解產物的HPLC分析

分析型HPLC檢測STS原料加熱前后的純度變化，起始原料STS（保留時間21.95 min）純度為96.57%，最大單雜純度為1.6% （圖1）；熱降解后STS（保留時間21.20 min）純度變為46.93%，產生兩種主要的降解產物組分A （保留時間12.74 min）和B（保留時間18.65 min），純度分別為17.68% 和18.41% （圖2）。

1.3.3所獲純品溶液經50 ℃減壓濃縮并凍干，得組分A 99.0 mg（無定形紅棕色粉末，HPLC純度為97.38%，保留時間12.68 min，圖3）、組分B 95.0 mg（無定形紅棕色粉末，HPLC純度為95.34%，保留時間19.08 min，圖4）。

2.2 質譜鑒定

質譜離子源為電噴霧離子源（ESI），負離子掃描模式檢測，毛細管電壓為3.0 kV，離子源溫度為100 ℃，霧化氣溫度為350 ℃，霧化氣流量為600.0 L·h-1，碰撞電壓分別為4.0 eV（MS） 和15.0～30.0 eV（MS/MS），掃描范圍m/z 100～2 000。對STS降解產物組分A和B純品進行測定。質譜測得組分A分子離子峰[M-Na]-質荷比（m/z）為389.33，推測其為分子式可能為C19H17O7SNa（符合其理論相對分子量為412.39）；質譜測得組分B分子離子峰質荷比（m/z）為371.26，推測其分子式可能為C19H15O6SNa（符合其理論相對分子量394.05）。

2.3 核磁共振鑒定

STS降解產物組分A和B純品各20 mg用D2O溶解后，進行1H NMR和13C NMR分析（表1），碳編號和結構見圖5，最終經解析確證組分A的結構為1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉，組分B的結構為1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉。

3 結論

本研究對STS原料進行高溫強制降解并分離純化后獲得兩個組分A和B，其可能的降解途徑為STS氧化生成1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉（組分A），隨后脫水生成1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉（組分B）。溫度為影響STS藥物穩定性的關鍵因素，STS制備工藝中丹參酮IIA磺化反應及可能的氧化反應對產品質量影響至關重要；而STS制劑采用高壓蒸汽滅菌，也可能會產生降解反應。研究表明，1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉和1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉為STS最主要的兩個降解產物。本文研究的方法能便捷、規?；刂苽涓呒兌鹊倪@兩個樣品，可為質量控制提供對照品。

致謝 感謝張江藥谷公共服務平臺在MS測定中提供的幫助；感謝上海交通大學分析測試中心吳節莉老師在NMR測定中提供的幫助。

參考文獻

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（收稿日期：2014-03-27）