慢性牙周炎患者血清miRNA-146a 的表達(dá)及其靶基因預(yù)測(cè)分析

陳 琳

慢性牙周炎(chronic periodontitis， CP ) 是發(fā)生在牙周支持組織的一種慢性感染性疾病， 主要是通過(guò)致病微生物及其毒素的刺激引發(fā)的宿主免疫失調(diào)，釋放炎癥介質(zhì)，造成局部組織損傷，其發(fā)病機(jī)制的研究不完全清楚，目前尚無(wú)十分有效的治療方法。

miRNA-146a 是一種與炎癥密切相關(guān)的miRNA，已被證明在免疫、腫瘤、炎癥等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。在CP 中，miRNA-146a 的研究情況如何，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)檢測(cè)miRNA-146a 在CP 患者血清中的表達(dá)變化，并對(duì)其進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分析， 旨在探討miRNA-146a 在CP 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及意義。

1. 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012 年12 月至2013 年12 月在廈門(mén)第174 醫(yī)院口腔科就診的患者，參照《牙周病學(xué)》[2]診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為CP 患者為研究對(duì)象。收集其血清標(biāo)本共計(jì)27 例， 其中輕度CP 10 例，中度CP 9 例， 重度CP 8 例；男性15 例，女性12例；年齡38-72 歲，平均60.26 歲。另選全口牙周探診深度≤3 mm， 無(wú)附著喪失， 出血指數(shù)≥3 的位點(diǎn)數(shù)不超過(guò)10%的健康者12 例正常血清作為健康對(duì)照組，其中男性6 例，女性6 例；平均60.58歲。所有研究對(duì)象均無(wú)全身性疾病， 女性未妊娠，就診前6 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行過(guò)牙周治療， 3 個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)抗生素及免疫抑制劑等， 無(wú)吸煙史。所有病例采集均遵循知情同意原則。所有血清標(biāo)本-80℃保存。

1.2 主要試劑和儀器 miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。實(shí)時(shí)定量PCR 儀7500(ABI，美國(guó))，超微量紫外分光光度儀PUEX UV(北京博凱思維)。

1.3 方法

1.3.1 QRT-PCR 檢測(cè)miRNA-146a 的表達(dá) 按miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以U6為內(nèi)參，引物序列及PCR 產(chǎn)物片斷大小為：U6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT，擴(kuò)增產(chǎn)物為94bp；miRNA-146a 上 游 GCTGAGAACTGAATTCCATGGGT ，下游引物為試劑盒提供的通用引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為76bp；引物由上海生工生物工程公司合成。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△CT 法進(jìn)行分析。

1.3.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA-146a 靶基因 采用miRDB(http:/ / miRNAdb.org/ miRDB)、

targetScan(http:/ / www.targetscan.org)、 mi-Randa (http:/ / mic-rorna.org)、 PicTar (http:/ / picTar.mdc-berlin.de)4 個(gè)軟件在線(xiàn)預(yù)測(cè)miRNA-146a 靶基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS17.0 進(jìn)行單因素ANOVA 和t 檢驗(yàn)， 采用GraphPad Prism5.0 進(jìn)行圖表制作，檢驗(yàn)水準(zhǔn)

α=0.05。

2. 結(jié)果

2.1 CP 患者血清miRNA-146a 的表達(dá)情況QRT-PCR 結(jié)果顯示CP 組miRNA-146a 明顯高于健康對(duì)照組，2-△△CT 值分別為分別為4.6567±4.3296、0.7748±0.7840，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)附圖。

附圖 兩組血清標(biāo)本miRNA-146a 表達(dá)比較

2.2 miRNA-146a 的表達(dá)與CP 臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 miRNA-146a 的表達(dá)與臨床分期有關(guān)，隨著疾病的加重而增高(P＜0.05)，與性別、年齡沒(méi)有明顯關(guān)系(P＞0.05)，見(jiàn)附表。

附表 miRNA-146a 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(±s)

附表 miRNA-146a 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(±s)

*表示P＜0.05

臨床病理參數(shù) 例數(shù) miRNA-146a 的表達(dá)(images/BZ_69_1723_2413_1737_2447.png±s)P 值性別男15 4.7201±4.5243 0.934女12 4.5775±4.2740年齡(歲)≥50 17 4.4344±4.3232 0.735＜50 10 5.0347±4.5471臨床分期輕度 10 1.8960±0.8558 0.007*中度 9 4.7434±4.4456重度 8 8.0100±4.7276

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果 TargetScan 預(yù)測(cè)miRNA-146a 靶基因?yàn)?00 個(gè)，PicTar 預(yù)測(cè)為130 個(gè)，miRanda 預(yù)測(cè)為6798 個(gè)，miRDB 預(yù)測(cè)為252 個(gè)。分析結(jié)果顯示miRNA-146a 調(diào)節(jié)的靶基因涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等各個(gè)方面。與牙周炎相關(guān)的基因有6 個(gè)：TLR4、CTSC、MPO、COL1A1、HSPG2、HLA-C。

3. 討論

miRNA 作為天然的基因調(diào)控因子， 在轉(zhuǎn)錄后的水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，它參與免疫細(xì)胞發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、炎癥以及骨破壞等生理病理過(guò)程，在維持免疫反應(yīng)的平衡及調(diào)控炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA-146a(MIMAT0000449)定位在于人染色體5q33-34。是一種與炎癥密切相關(guān)的miRNA，在T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫和炎癥細(xì)胞中高表達(dá)[3]，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-146a 在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細(xì)胞和滑膜組織中表達(dá)增多，從而加重了炎癥反應(yīng)[4]。而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)miRNA-146a 表達(dá)增多卻減輕了免疫炎癥反應(yīng)[5]。

本文采用QRT-PCR 方法，檢測(cè)CP 患者血清中miRNA-146a 的表達(dá)情況，結(jié)果與健康對(duì)照組相比，在CP 中高表達(dá)，高表達(dá)的miRNA-146a 與性別、年齡沒(méi)有明顯關(guān)系，但與臨床分期有關(guān)，隨著疾病的加重而增高。提示miRNA-146a 可能與CP 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

由于miRNA 功能的發(fā)揮是通過(guò)自身直接與靶基因相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。miRNA 的靶基因參與某個(gè)生物學(xué)過(guò)程或者通路，就說(shuō)明這個(gè)miRNA 參與調(diào)控這個(gè)生物學(xué)進(jìn)程或通路，因此可以通過(guò)研究miRNA 靶基因的功能來(lái)研究該miRNA 的功能。本文通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-146a 的靶基因很多，4 個(gè)軟件同時(shí)預(yù)測(cè)出的靶基因數(shù)目沒(méi)有，3 個(gè)軟件預(yù)測(cè)出的靶基因有36 個(gè)。miRNA-146a 的靶基因參與細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等各個(gè)方面的調(diào)控。與CP 相關(guān)的基因有6 個(gè)，TLR4、CTSC 是其中之一。

TLR4(Toll like receptor4)是Toll 樣受體家族成員之一， 能識(shí)別細(xì)菌的脂多糖(lipopoly-saccharides，LPS)，介導(dǎo)內(nèi)毒素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過(guò)核因子-κB(nuclear factor-kappaB， NF-κB)通路引發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。于慧等[7]對(duì)638 例慢性牙周炎患者外周靜脈血提取基因組DNA，采用TaqMan MGB探針?lè)▽?duì)TLR2/ TLR4 共9 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，證實(shí)TLR4 基因多態(tài)性與牙周炎的易感性有密切相關(guān)性，其單核苷酸多態(tài)性會(huì)影響牙周疾病嚴(yán)重程度的進(jìn)展，導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥應(yīng)答損傷，引起牙周組織更嚴(yán)重的破壞。

組織蛋白酶C(cathepsin C ，CTSC)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶。位于常染色體11q14.1-q14.3，全長(zhǎng)約46kb，含有7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子。它的主要功能是參與蛋白質(zhì)降解、酶的活化以及多種免疫和炎癥反應(yīng)。有研究表明CTSC 基因突變將導(dǎo)致其功能改變，蛋白活性喪失，從而抑制了對(duì)病原微生物引起的牙齦和牙周深部組織感染的免疫炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致牙齒脫落[8]。

綜上所述，miRNA-146a 可能通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控參與CP 的發(fā)生發(fā)展，具體機(jī)制尚需細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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