流動注射分析測定牛奶中尿素的方法研究

沈東旭

摘要：

目的：尋找一種快速測定牛奶中尿素含量的分析方法。方法：樣品中加入三氯乙酸溶液，高速離心后取5 mL清液，過0.22 μm水相濾膜（聚醚砜）后通過AA3流動注射分析儀在線測定尿素含量。結果：尿素濃度在0 - 300 mg/kg范圍內，可獲得良好線性，相關系數r為0.9996，檢出限為5.3 mg/kg，在添加水平50和100 mg/kg條件下，回收率范圍98.2 - 101 %，日內和日間精密度范圍2.7 - 3.6 %。結論：該方法具有較高的穩定性，耐用性，精密度和準確度，操作簡單，適用于牛奶中尿素含量的快速測定。

關鍵詞：流動注射；尿素；牛奶

【中圖分類號】

TU266+.2 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）05-0234-02

尿素是乳液的常規組分并構成非蛋白氮的一部分^[1]。一般情況下，牛奶中尿素的正常含量范圍為200 - 300 mg/kg。但是，個別不法商販通過在鮮奶中人為添加尿素來提高總氮含量，這不僅影響了牛奶的營養價值，更重要的是給消費者身體健康造成危害^[2]。因此，建立一種牛奶中尿素含量的快速檢測方法以加強對牛奶品質監管具有重要意義。

流動注射分析法，實現了尿素和試劑的在線混合反應，并將樣品的分析和結果報告全部自動化，避免了人工操作的不穩定性，簡化了操作程序。趙立晶^[3]等首次采用流動注射法測定奶制品中的尿素，使用在線透析去除脂肪等影響，方法簡便，但是在線透析裝置價格昂貴，且濾膜需要經常更換。本實驗中我們采用新型的氣泡隔斷式流動分析儀，信號更加穩定，靈敏度更高，并通過降低樣品量，很好消除了脂肪對檢測的影響，取得了良好的效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑：

AutoAnalyzer 3（AA3）流動注射分析儀（德國SEAL公司）：尿素分析模塊，520nm濾片；Millipore 超純水設備（美國Millipore公司），分析天平BT224S（北京賽多利斯儀器系統有限公司），ST16R高速冷凍離心機（美國賽默飛公司），渦旋混合器Lab Dancer S25（德國IKA公司）

尿素（H2NCONH2），三氯乙酸（CCl3COOH），氨基硫脲（CH5N3S），二乙酰一肟（C4H7NO2），磷酸（H3PO4），硫酸（H2SO4），三氯甲烷（CHCl3）均為分析純或者優級純試。實驗用水為Millipore純水。

酸溶液：300 mL磷酸中加入10 mL濃硫酸，用純水稀釋至500 mL；可長期放置。

二乙酰一肟溶液：將5 g二乙酰一肟溶解在200 mL純水中?？梢员４鎯芍堋?/p>

氨基硫酸溶液：將0.25 g氨基硫脲溶解在100 mL純水中?？梢员４鎯芍?。

尿素標準溶液（100 μg/mL）：準確稱取0.1000 g尿素于小燒杯中，加少量純水溶解后轉入1000 mL容量瓶中，加0.1 mL三氯甲烷并用純水定容，此溶液每毫升含0.1 mg尿素。冷藏保存。移取適量尿素標準溶液，用15 %三氯乙酸溶液稀釋定容，配制標準曲線。

1.2 樣品前處理： 稱取2.5 g樣品于50 mL離心管中，加入22.5 mL 15 %三氯乙酸溶液，渦旋混合30 s。接著以7500 r/min，10 ℃高速離心5 min，然后用針筒吸取約5 mL清液，過0.22 μm水相濾膜（聚醚砜）后進行分析。

1.3 儀器參數： 測量波長為520 nm； 分析速率為40 個樣/h； 取樣時間60 s，沖洗時間30 s，在線加熱溫度為95 ℃。

2 結果與討論

2.1 前處理條件研究： 本實驗中考察了環己烷除脂對實驗的影響。同一份牛奶樣品采用2種前處理方法。A方法同1.2，B方法比A方法多了一步，在離心后濾液中加入10mL正己烷，取下層液體5mL進行測定。配對T檢驗結果如表1所示，，查表得t（0.05，9）=2.26，tD

2.2 方法確證：

根據歐盟2002/657/EC^[4]的授權文件，確定方法的穩定性、耐用性、線性范圍、檢出限、回收率以及精密度等。

2.2.1 穩定性：

通過調節樣品的冷藏時間和分析時間，4℃下保存0，1，7，14，21天；將稱量后的牛奶放在空氣中0，5，10，30，60 min后進行分析，結果顯示，實驗數據沒有顯著差異，尿素在本實驗條件下十分穩定，所以實驗周期可以很長。

表1 2種方法測定尿素含量的數據對比

2.2.2 耐用性：

實驗中考察了最重要的因素三氯乙酸濃度對結果的影響，分別使用10%，12%，15%，20%，25%三氯乙酸提取同一份牛奶中的尿素。實驗結果顯示，尿素的回收率在92.5-102%之間，對實驗結果沒顯著性影響。說明此方法允許三氯乙酸濃度在較寬的范圍內變化，增加了方法的可操作性。

2.2.3 線性范圍和檢出限：

配制系列質量濃度（0、10、50、100、150、200、300 mg/kg）的尿素進行測定，以質量濃度為橫坐標，峰高為縱坐標，繪制標準曲線。尿素濃度在0 - 300 mg/kg范圍內具有良好的線性關系，線性方程為Y=0.1915x+0.3169，r=0.9996（x是尿素濃度，mg/kg；Y是峰高百分比，%）

根據EPA關于方法檢出限的定義，對20 mg/kg的尿素標準溶液平行前處理8份，測定峰高，并換算到尿素濃度并計算標準偏差S。檢出限：DL=S * t（n-1，0.99）（S是平行測定的標準偏差；t（n-1，0.99）是置信區間99 %，自由度為n-1時的t值，當n=8， t（7，0.99）=2.998）。根據計算，檢出限為5.3 mg/kg。

2.2.4 精密度和回收率： 在同一份牛奶樣品中，添加尿素標準溶液，添加水平為50， 100 mg/kg，測定3天，每天重復6次，回收率和精密度結果見表2。

表2 方法的精密度和準確度

2.3 實際樣品分析：

對市場上常見的10種牛奶樣品中的尿素進行檢測，如表1，結果顯示，尿素含量范圍為187.8 - 281.1 mg/kg。

3 結論

本文介紹了一種用于牛奶中尿素含量的大批量快速測定方法。采用三氯乙酸溶液作為提取試劑，提取液直接通過AA3流動分析儀進行檢測。操作簡單，消耗溶劑少，每小時可以分析40個樣品，為鑒別牛奶中是否摻加尿素提供了一種有效的測定方法。

參考文獻

[1] 趙旭博， 董文賓， 王順民等. 國外牛奶中尿素含量檢測新進展[J]. 食品研究與開發， 2004， 25 （6）： 109 - 114

[2] 翟永信編. 食品摻偽監測方法[M]. 北京： 北京大學， 1992

[3] 趙立晶， 閆杰， 馬東升等. 在線透析-流動注射光度法測定奶及奶制品中尿素含量[J]. 分析化學， 2011， 39（2）： 183-187

[4] 2002/657/EC， Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Off J Eur Commun. 2002， L221， 8 - 36.