急性白血病患者HPA-1～6，15基因多態性與血小板輸注療效的相關性研究

苗菁，曾小菁

（貴陽醫學院附屬醫院血液科，貴州貴陽 550004）

·論著·

急性白血病患者HPA-1～6，15基因多態性與血小板輸注療效的相關性研究

苗菁，曾小菁

（貴陽醫學院附屬醫院血液科，貴州貴陽 550004）

目的通過檢測人類血小板抗原1～6,15系統(Human platelet alloantigen，HPA-1～6,15)，探討HPA多態性與血小板輸注療效的相關性。方法(1)收集30例輸注2次以上血小板的急性白血病患者外周血標本，根據血小板回收率（Percentage platelet recovery，PPR)判定輸注效果；(2)采用酚/氯仿方法提取DNA；(3)采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物（Polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法在相同條件下對血小板抗原HPA-1～6,15進行基因分型，分析HPA抗原與血小板輸注療效的關系。結果(1)HPA-1～3、HPA-5～6、HPA-15系統等位基因呈多態性分布；HPA-4呈aa純合子單態性分布，HPA-1、5、6基因以aa純合子為主，僅HPA-3、15見bb純合子，b等位基因頻率以HPA-2最高(0.65)，其次依次為HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)。(2)30例急性白血病患者中有21例血小板輸注無效，無效率為70%，多集中于輸注3次及以上組。結論(1)抗-HPA引起血小板輸注無效概率較小，主要發生在HPA-2、3、15系統，對需作HPA配型的患者只要針對此3個系統進行檢測，就可提高輸注效果。(2)臨床應注重血小板輸注治療的個體化，減少輸注次數，提高輸注療效。

血小板輸注；療效；急性白血病；血小板特異抗原；基因多態性

隨著輸血醫學的不斷發展，成分輸血的推廣使用，血小板輸注已成為臨床輸血治療疾病的重要手段之一。但部分患者在輸注血小板后出血癥狀仍無改善，血小板計數水平仍舊很低。而只要2次及2次以上給予足量血小板，血小板增值未達預期值，即可定義為血小板輸注無效(Platelet transfusion refractoriness，PTR)[1]。近年來隨著血小板輸注的日益增加，PTR成為制約臨床治療的一大難題。在臨床血小板輸注過程中，如果血小板同種抗原不合．可導致機體產生血小板同種抗體，引起PTR。人類血小板抗原系統(Human platelet alloantigen，HPA)為血小板特有，具有獨特的遺傳多態性，可介導同種免疫性抗體的產生。為了研究血小板基因遺傳多態性在血小板輸注療效的影響，我們應用聚合酶鏈反應一序列特異性引物(Polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)技術，選取急性白血病患者，對HPA1-6, 15系統在同一擴增條件下進行同步擴增，用病例間比較的方法，探討HPA1-6,15基因多態性與血小板輸注療效的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料考慮到急性白血病為臨床接受血小板輸注最多的人群，故選取30例急性白血病患者為研究對象，均為2012年6～10月在貴陽醫學院附屬醫院血液科住院患者。其中急性淋巴細胞白血病4例，急性髓細胞白血病26例，均符合各型急性白血病診斷標準[2]，男性17例，女性13例，年齡12～63歲，平均(43±7.31)歲。

1.2 血小板懸液輸注所用血小板懸液均由貴州省血液中心提供。制劑懸液均達到國家質量標準。機采1個治療量單采血小板為200～250 ml，含血小板數≥2.5×1011；手工制備血小板1 U由200 ml全血分離25～30 ml，含血小板數2.5×1010，輸入10 U相當于機采血小板1個治療量[1]。

1.3 血小板輸注指征及用法血小板輸注指征：入選患者化療后血小板＜10×109/L或≥10×109/L但伴感染發熱或有出血傾向時輸注血小板[3]，每次輸注濃縮血小板10 U或單采血小板一個治療量。

1.4 血小板輸注效果評價血小板輸注效果評價用血小板回收率PPR(Percentage platelet recovery)來評價，輸注后24 h PPR＞20%即判斷為輸注血小板有效[1]。

1.5 主要儀器和試劑梯度PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)，PE9700擴增儀(美國ABI公司)，Taq聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；PCR引物序列設計參見文獻[4]，每一個HPA系統設計三條引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成提供。

1.6 統計學方法采用SPSS13.0軟件包進行統計學分析。根據電泳條帶確定每個標本的基因型，等位基因頻率用直接采用基因計數法，計算HPA-1～6,15系統的各基因型、基因頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，組間比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPA基因分型擴增產物鑒定內對照帶引物為人類生長激素，均為429 bp，電泳結果顯示每孔均可見清晰的內對照帶，陰性孔中無特異性擴增帶，表明無相應的基因。陽性孔中除外內對照帶可見清晰、特異的擴增帶(片段大小參照表中目的條帶的堿基數)，表示有相應的基因。結果見圖1和圖2。

圖1 一例樣本的HPA 1-6,15分型

圖2 HPA 2、3、15圖例

2.2 輸注血小板次數與輸注效果的比較按輸注次數分為＜3次及≥3次組，計算24 h PPR后結果：30例中僅9例達到輸注有效標準，總有效率為30%，且大多集中于輸注＜3次組。證明血小板輸注次數與輸注效果有關，血小板輸注有效率隨輸注次數增加而下降。

2.3 30例樣本HPA-1～6,15等位基因分布比較結果顯示，可見僅HPA-4均表現aa純合子，呈單態性表現，其余均表現有多態性；HPA-1、5、6以aa純合子基因型為主；b等位基因頻率以HPA-2最高(0.65)，其次依次為HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)，見表1。

表1 HPA-1～6,15等位基因分布比較

2.4 輸注有效組與無效組HPA-1～6,15等位基因頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗本實驗除無效組中HPA-2基因頻率(P＜0.05)不符合Hardy-Weinberg平衡定律外，其他系統實際基因頻率與理論基因頻率分布差異均無統計學意義(P＞0.05)，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，見表2。

2.5 血小板輸注有效組和無效組的HPA-1～6, 15基因型和基因頻率比較血小板輸注有效組和無效組基因型頻率、基因頻率之間的差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

注：aP＜0.05，即不符合Hardy-Weinberg平衡定律。NA，無效。

表3 血小板輸注有效組、無效組的HPA-1～6,15基因型和基因頻率的比較

3 討論

臨床上，血小板輸注對預防和治療血小板減少或功能缺陷患者的出血是一種有效治療方法。由于血小板來源少，保存困難，費用高，輸注過多不僅增加患者的經濟負擔，浪費血源，還可能引起與血小板輸注相關的不良反應而導致PTR。有研究認為反復多次的血小板輸注可使HLA和HPA類抗原刺激患者機體產生同種免疫反應，導致外源性血小板破壞，且輸注次數越多，檢出血小板抗體的陽性率就越高，這是引起血小板輸注無效的重要原因[5]。本研究結果顯示輸注3次及以上血小板輸注無效率明顯上升，血小板輸注無效率達70%，與文獻報道血小板輸注無效率30%～70%[6]相符。

根據一份綜合調查報告表明，盡管輸注血小板無效涉及因素甚多，但認為與血小板抗體密切相關[7]。國外血小板抗體高發頻率調查結果顯示，同種人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)抗體的頻率最高，其次是HPA抗體。選擇HLA配合的血小板，或HLA以及HPA都配合的血小板，是一個減少血小板輸注無效的方法之一[8-9]。發生HPA免疫機會的多少與人群中HPA抗原分布頻率有關，HPA系統中對偶抗原不配合的比例越高，產生HPA抗體的機會越多，產生PTR的可能性越大。國外文獻報道白種人易引起PTR的血小板特異性抗原有HPA-1a、HPA-lb、HPA-2b、HPA-3a、HP-3b、HPA-4a、HPA-5b等[10]；我國青島、上海、南京、石家莊和成都等地血液中心已開展血小板抗原基因分型檢測，通過血小板抗原基因多態性分析，發現各地HPA多態性分布均表現有一定的地域性差異，但以HPA-15a/b、HPA-3a/b、HPA-2a/b、HPA-5a/b、HPA-4a/b的不配合率較高，此外國內研究曾經在PTR患者中檢出HPA-2b抗體[11]。本實驗結果顯示，實驗組HPA-4呈aa純合子單態性分布，HPA-1～3、5～6、15等位基因頻率均呈多態性分布，以HPA-2雜合度最高；HPA-1、5、6以aa純合子基因型為主，僅HPA-3、15見bb純合子；b等位基因頻率以HPA-2最高(0.65)，其次依次為HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)，與文獻報道中國大部分地區漢族人群b等位基因頻率表達前三位依次為HPA-15、HPA-2、HPA-3的抗原系統一致，但順序略有不同[12-13]。由此可推論：HPA-15、HPA-2、HPA-3系統有高度多態性，較易發生由基因不相合引起的免疫反應，是HPA多態性導致PTR的主要影響抗原系統。

董偉群等[14]對PTR的免疫性因素的相關研究提示：免疫因素所致PTR中90%是由抗-HLA引起，黃種人產生抗-HPA僅占10%左右。李志強等[15]曾對49名反復輸血的惡性血液病患者進行抗-HLA與抗-HPA篩查試驗報道，多數患者相繼出現抗-HLA，而始終未檢出抗-HPA，故認為抗-HPA非血小板輸注無效的主要原因。而本實驗數據顯示，血小板輸注有效組和無效組之間HPA-1～6,15系統基因型和基因頻率的差異未發現有統計學意義(P＞0.05)，也證實抗-HPA在導致PTR各因素中所占比例不大，可不考慮其為導致PTR的主要原因，擴大樣本例數還可進一步論證。

本實驗結果見輸注無效組HPA-2基因頻率不符合Hardy-Weinberg平衡法則。根據既往文獻理論：Hardy-Weinberg平衡本質上是一種理想狀態，其假設條件在一般人群中很難得到滿足，因此Hardy-Weinberg平衡是相對的，主要針對正常無疾病人群，因為疾病本身就是一種選擇限制，不屬于隨機選擇，不平衡是正常的[16-17]。本實驗樣本均選自急性白血病患者，進行的是病例間療效比較，所以出現不平衡仍可進行結果分析。

綜上所述，在未來的臨床工作中，輸注血小板應防范多因素所致輸注無效的風險，其中因抗-HPA引起PTR的比例很小，對反復多次發生PTR患者即使考慮與HPA基因多態性有關，需作HPA配型時，多數人只需檢測供者與受者HPA-2、3、15基因就可有效減少血小板輸注無效的發生。這樣既縮短試驗時間，降低試驗成本、又保證患者能夠及時、有效地接受輸注血小板治療。

[1]胡麗華.檢驗與臨床診斷分析[M].北京:人民軍醫出版社,2009: 60-62.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京:科學出版社,2007:103-121.

[3]汪聲恒.急性白血病患者預防性血小板輸注的閾值[J].白血病·淋巴瘤,2004,13(3):181-182.

[4]Kupatawintu P,Nathalang O,Charoen R,et al,Gene frequencies of the HPA-1 to 6 and Gov human platelet antigens in thai blood donors[J].Immunohematol,2005,21(1):5-9.

[5]馬印國,李振奇,王全立.血小板抗體檢測技術進展[J].中華檢驗醫學雜志,2006,11(29):1041-1044.

[6]Legler TJ,Fischer I,Dittmann J,et al.Frequency and causes of refractoriness in multiply transfused patients[J].Ann Hematol,1997, 74(3):185-189.

[7]Novotny VM.Prevention and management of platelet transfusion refractoriness[J].Vox Sang,1999,76(1):1-13.

[8]Haddad SA,L ichtiger B,Klein HG.In vivo efficacy of shipped HLA2 matched platelet[J].Transfusion,2006,46(8):1306-1310.

[9]Feng ML,Liu DZ,Shen W,et a1.Establishment of an HPA-1 to 16 typed platelet donor registry in China[J].Transfus Med,2006,16: 369-374.

[10]Davoren A,Curtis BR,Aster RH,et al.Human Platelet antigen-specific alloantibodies implicatedinll cases 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia[J].Transfusion,2004,44(8): 1220-1225.

[11]焦淑賢,楊志夏,趙林.血小板輸注無效[J].中國輸血雜志, 2008,1(4):302-306.

[12]戴宇東.中國漢族人群HPA分型單采血小板供者庫的建立模式與庫容[J].中國實驗血液學雜志,2010,18(4):1046-1050.

[13]李志強.血小板無效輸注風險度與HPA-1～16基因鑒定價值[J].中國輸血雜志,2009,22(5):343-344.

[14]董偉群,郭萍,佟力.血液病患者血小板無效輸注的免疫因素探討[J].中國輸血雜志,2009,22(4):30-41.

[15]李志強,樂嘉宜.人類血小板抗原1～16基因與血小板輸注無效風險研究[J].中國輸血雜志,2009,22(5):346-349.

[16]劉紅,胡永華.遺傳流行病學研究中的H-W平衡檢驗[J].中南大學學報(醫學版),2010,35(1):90-93.

[17]Zou GY,Donner A.The merits of testing Hardy-Weinberg equilibrium in the Analysis of unmatched case-control data:acautionary note[J].Ann Hum Genet,2006,70(6):923-933.

Correlation between polymorphism of HPA-1～6,15 and the effect of platelet transfusion in patients with acute leukemia.

MIAO Jing,ZENG Xiao-jing.Department of Hematology,the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo study the correlation between polymorphism of Human platelet antigens(HPA) and the effect of platelet transfusion,through testing the gene of the HPA-1～6,15.Methods(1)The peripheral blood simples of 30 patients with acute leukemia who had accepted platelet transfusion for two or more times were collected. The effect of platelet transfusion was evaluated by percentage platelet recovery(PPR).(2)The method of phonelic/ chloroform was applied to extract DNA.(3)PCR with sequence specific primers(PCR-SSP)was used to type HPA1～6,15 under the same conditions.The curative effect of platelet transfusion was observed.Results(1)The system alleles of HPA-1～3,HPA-5～6,HPA-15 showed polymorphism distribution;HPA-1,5,6 mainly showed aa homozygous genotype,HPA-4 presented homozygous single-state distribution,only HPA-3,15 presented bb homozygous genotype;HPA-2 had the highest heterozygous level(0.65),followed by HPA-15(0.349),HPA-3(0.3).(2)Platelet transfusion refractoriness(PTR)was found in 21 of the 30 patients of acute leukemia,with the rate of inefficiency of 70%, mainly concentrated in the patients undergoing 3 or more times of platelet transfusion.Conclusion(1)A few case of PTR is caused by anti-HPA,and testing HPA-2,3,15 genes maybe enough to improve the effect of platelet transfusion for patients of HPA matching.(2)Patients individualization should be taken into consideration in clinical practice, in order to reduce the chance of repeated transfusion and increase the effective rate.

Platelet transfusion;Effect;Acute leukemia;Human platelet antigens(HPA);Polymorhism

R733.71

A

1003—6350（2014）03—0313—05

2013-05-07)

曾小菁。E-mail：gymj0218@163.com