基于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的唾液乳桿菌滲脅迫響應(yīng)代謝組學(xué)研究

龔霄，齊寧利，林麗靜，陳晶瑜，韓北忠，*

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東湛江524001；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

基于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的唾液乳桿菌滲脅迫響應(yīng)代謝組學(xué)研究

龔霄1，2，齊寧利1，林麗靜1，陳晶瑜2，韓北忠2，*

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東湛江524001；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了高滲脅迫下唾液乳桿菌胞內(nèi)代謝物變化，結(jié)果表明：不同細(xì)胞代謝模式下，氨基酸類、有機(jī)酸類、脂肪酸類、胺類和糖類及其衍生物等具有顯著差異，這些代謝物直接參與了細(xì)胞滲透脅迫響應(yīng)相關(guān)的主要生化反應(yīng)和關(guān)鍵代謝通路。

唾液乳桿菌；滲透脅迫響應(yīng)；氣質(zhì)聯(lián)用；代謝組學(xué)

乳酸菌是指一類不產(chǎn)孢子、可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的厭氧或兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性球菌或桿菌的統(tǒng)稱[1]。乳酸菌具有調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡、提高免疫力、抗腫瘤、降膽固醇和延緩衰老等諸多生理功效，是同人類生活密切相關(guān)的重要益生菌之一，已被成功應(yīng)用于乳制品、肉制品、果蔬和谷物等發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)。

在工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中，乳酸菌面臨酸或堿、氧氣、溫度、滲透壓、饑餓等多種因素的脅迫，往往引起細(xì)胞活性衰減，甚至凋亡。高滲壓是一種重要的食品貯藏手段，通過(guò)降低水分活度、減少溶解氧，從而抑制或消除微生物引起的腐敗或污染。作為一種典型的脅迫環(huán)境，高濃度鹽/糖加速活性氧簇的生成，抑制或阻斷細(xì)胞中正常代謝活動(dòng)，從而制約乳酸菌生產(chǎn)性能及益生功效的發(fā)揮[2]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，微生物逐漸形成了應(yīng)激防御系統(tǒng)。研究較多的是大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草桿菌、單增李斯特、植物乳桿菌和乳酸乳球菌，但主要集中在基因和蛋白水平[3-9]。采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究唾液乳桿菌高滲脅迫下代謝物組的變化規(guī)律，有利于從代謝水平上全面揭示乳酸菌滲透調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

唾液乳桿菌FDB 86由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品教育部北京市共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

液體培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，檸檬酸三銨2 g，K2HPO42 g，MgSO40.5 g，MnSO40.25 g，NaAc 5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.8，121℃滅菌20 min備用。在液體培養(yǎng)基中添加適量NaCl（0.8 M），即為高滲培養(yǎng)基。N-甲基-N-（三甲硅基）三氟乙酰胺（MSTFA，≥98.5%，色譜純），甲氧胺鹽酸鹽（OMHA，≥98.5%，分析純），核糖醇（99%，標(biāo)準(zhǔn)品），無(wú)水吡啶（≥99%，色譜純）購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；色譜級(jí)甲醇、氯仿購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

6890-5973 N氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；LGJ-18低溫真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技公司；UF/UVPL5124超純水制備儀：美國(guó)Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

穩(wěn)定期唾液乳桿菌細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)0.45 μm濾膜抽濾，生理鹽水沖洗2次～3次，迅速收集菌體并用液氮淬滅。采用甲醇/氯仿/水（1∶1∶1）溶劑體系提取，8 944×g離心5 min收集水相，加入核糖醇母液至終濃度為0.05 mmol/L，然后進(jìn)行低溫真空冷凍干燥。

1.3.2 GC/MS分析

參照于海龍的方法將提取物衍生化[10]。測(cè)試條件如下：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，F(xiàn)olsom，CA）；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量2 μL；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。升溫程序：初始爐溫60℃，保持1 min，以20℃/min線性升溫至230℃，保持1 min，再以15℃/min升溫至280℃并保持10 min；接口溫度250℃，離子源溫度230℃。質(zhì)譜條件：溶劑延時(shí)4.2 min；電離方式：EI；電子能量70 eV，掃描范圍：m/z 40～600。

2 結(jié)果與分析

2.1 唾液乳桿菌胞內(nèi)代謝物模式識(shí)別

對(duì)不同條件下的穩(wěn)定期唾液乳桿菌胞內(nèi)代謝物組進(jìn)行主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同條件下的代謝物樣本分布于PCA模型不同象限，在PC1和PC2維度上都達(dá)到了較好的區(qū)分效果，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.01%。

2.2 唾液乳桿菌滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝差異分析

通過(guò)GC/MS檢索發(fā)現(xiàn)40多種代謝物，包括氨基酸類、有機(jī)酸類、脂肪酸類、胺類和糖類等，見(jiàn)表1。磷酸類物質(zhì)參與細(xì)胞中多種生物大分子結(jié)構(gòu)組成，作為中間代謝物與能量代謝直接偶聯(lián)。如磷酸葡萄糖酸的積累和磷酸戊糖途徑直接相關(guān)，它為生物體中還原性生化合成反應(yīng)提供NADPH（磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，即輔酶Ⅱ），并為核酸合成提供戊糖。糖代謝加強(qiáng)導(dǎo)致由糖氧化及磷酸戊糖循環(huán)提供的乙酰CoA及NADPH增多，有利于磷脂酰脂肪酸積累，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪酸合成。十六烷酸和十八烷酸參與了細(xì)胞中的脂類代謝，并且和膽堿、肉毒堿的代謝呈相關(guān)；十八碳三烯酸參與細(xì)胞膜和生物酶構(gòu)成，有利于提高逆境下細(xì)胞膜流動(dòng)性。N-乙酰葡糖胺是許多雜多糖的組成成分，去酰基后生成葡萄糖胺，有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持；甘油硬脂酸酯具有較強(qiáng)乳化能力，可有效降低水的表面張力，有利于滲透脅迫下細(xì)胞內(nèi)水分的保持；麥角固醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成成分，它在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、與膜結(jié)合酶的活性、膜的流動(dòng)性、細(xì)胞活力等方面起著重要作用。高滲脅迫下，甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和異亮氨酸含量明顯上調(diào)，而谷氨酰胺的積累顯著下降；鳥氨酸不屬于必需氨基酸，但存在于短桿菌酪肽、短桿菌肽S等的抗菌性肽中，作為尿素循環(huán)的一部分與尿素生成相關(guān)[11]。在生物體內(nèi)與精氨酸、谷氨酸、脯氨酸能相互轉(zhuǎn)變，可與α-酮酸、乙醛酸進(jìn)行氨基轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步合成多胺，高滲脅迫顯然促進(jìn)了這一途徑的反應(yīng)，使鳥氨酸得以利用；此外，唾液酸的合成受到抑制，其相關(guān)益生功效也必然會(huì)受到影響[12]。

表1 唾液乳桿菌胞內(nèi)代謝物PCA模型之間的差異代謝物Table 1 Metabolites derived from L.salivarius PCA models

3 結(jié)論

采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同培養(yǎng)條件下唾液乳桿菌胞內(nèi)代謝物組進(jìn)行了分析，找到多組差異代謝物，這些物質(zhì)直接或間接參與細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)，是抵抗?jié)B透脅迫的潛在生物標(biāo)志物。通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)，不同處理下的代謝樣本得到了較好區(qū)分，表明基于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)研究在一定程度上有助于區(qū)分唾液乳酸菌不同培養(yǎng)條件下的代謝模式。由于樣品分析中也存在定性定量的困難，將不同代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行整合，對(duì)探究微生物脅迫響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

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GC/MS Based Metabonomics Study on Osmotic Response of Lactobacillus salivarius

GONG Xiao1，2，QI Ning-li1，LIN Li-jing1，CHEN Jing-yu2，HAN Bei-zhong2，*
（1.Agriculture Product Processing Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences，Zhanjiang 524001，Guangdong，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

In this work，intracellular metabolite profiles of Lactobacillus salivarius on hypertonic stress were analyzed using GC/MS method，and the result showed amino acids，organic acids，fatty acids，amines，and sugars and their derivatives were significantly different between different metabolic models，which were directly involved in the cell response to osmotic stress-related biochemical reactions and key metabolic pathways.

Lactobacillus salivarius；osmotic response；GC/MS；metabonomics

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.003

2014-04-24

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（1630062014019）；十一五國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題支持（2006BAD04A06）

龔霄（1984—），男（漢），副研究員，博士，主要研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者