甲殼素及其衍生物的制備與抑菌活性研究

尹秀蓮，游慶紅，3，周興海

（1.淮陰工學院江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室，江蘇淮安223001；2.南京大學淮安高新技術(shù)研究院，江蘇淮安223001；3.江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點實驗室，江蘇淮安223300）

甲殼素及其衍生物的制備與抑菌活性研究

尹秀蓮1，2，游慶紅1，2，3，周興海1

（1.淮陰工學院江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室，江蘇淮安223001；2.南京大學淮安高新技術(shù)研究院，江蘇淮安223001；3.江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點實驗室，江蘇淮安223300）

對從龍蝦廢棄物制備的甲殼素、殼聚糖及其衍生物甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對3種G-菌與3種G+菌的抗菌活性進行了研究。MIC試驗結(jié)果表明甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所有測試菌株的MIC均＜0.01%，比甲殼素、殼聚糖表現(xiàn)出更高的抑菌活性。通過繪制生長曲線，對4種物質(zhì)的抑菌活性進行研究，結(jié)果表明0.1%的殼聚糖能抑制64%的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，說明桿菌屬對殼聚糖比較敏感，甲殼低聚糖對G+菌都表現(xiàn)出較強的抑菌作用，氨基葡萄糖鹽酸鹽能完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。甲殼素和殼聚糖對G-大腸桿菌、綠膿假單胞菌有一定的抑制作用，對沙門氏菌基本沒有抑制作用。0.1%的甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G-菌的抑制作用較強。甲殼素和殼聚糖可作為較有效的抑菌劑，甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽可作為幾種受試G-菌的殺菌劑。

甲殼素；殼聚糖；甲殼低聚糖；氨基葡萄糖鹽酸鹽；抑菌

甲殼素以高度有序的結(jié)晶微纖維形式廣泛存在于蝦殼、蟹殼、昆蟲外殼、真菌和藻類等細胞壁中，是地球上除蛋白質(zhì)外含氮量最高的天然有機化合物[1]，殼聚糖是甲殼素經(jīng)脫乙酰基后的產(chǎn)物，是一種天然高分子的多糖化合物，殼聚糖是目前研究得比較多的一種天然防腐保鮮劑，甲殼素和殼聚糖由于其分子結(jié)構(gòu)中內(nèi)外氫鍵的相互作用，形成了有序的大分子結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量通常在幾十萬至幾百萬，不溶于水等一般溶劑，應用受到極大限制。經(jīng)過降解得到的低相對分子質(zhì)量殼聚糖不僅溶解性好，而且具有某些獨特的性質(zhì)[2-3]。D-氨基葡萄糖鹽酸鹽又稱葡萄糖胺鹽酸鹽，葡萄糖結(jié)構(gòu)中C2-羥基被氨基取代，鹽酸與氨基成鹽，是甲殼素的一種重要衍生物[4]。

近年來，甲殼素、殼聚糖及其衍生物對不同的微生物例如細菌、酵母菌及真菌等的抑制作用引起學者們廣泛的重視，并對其抑菌機制進行了研究[5-6]。關于殼聚糖在食品防腐保鮮方面的應用的研究越來越多，但是在殼聚糖的抑菌機理和抑菌特性方面，不同的研究者得出的結(jié)論去不盡相同[7]。目前，雖然對甲殼素、殼聚糖及其衍生物的抑菌活性研究較多，但是大多都是對其中的單個成分的抑菌活性研究，系統(tǒng)研究較少。本實驗以龍蝦廢棄物為原料，制備甲殼素、殼聚糖及甲殼低聚糖，并對其抑菌活性進行系統(tǒng)研究比較，為甲殼素、殼聚糖及其衍生物在食品、飼料等工業(yè)領域的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

三株G+：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）， 枯 草 芽 孢 桿 菌 （Bacillus subtilis，ATCC6633）， 蠟 樣 芽 孢 桿 菌 （Bacillus cereus，ATCC11778）；三株G-：大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC25922），綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）， 沙 門 氏 菌 （Salmonella typhi，ATCC14028），購于ATCC菌種保藏中心。

1.1.2 主要材料與試劑

龍蝦殼：取自江蘇盱眙地產(chǎn)龍蝦；其余所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實驗儀器

QYC－211恒溫搖床：上海福馬實驗設備有限公司；BCM－1000超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；UV－2401PC紫外分光光度計：日本島津。

1.2 方法

1.2.1 甲殼素及殼聚糖的制備

采用參考文獻[8]的方法，以龍蝦殼為原料，酸堿法處理后，得到甲殼素。甲殼素在NaOH溶液中回流脫乙酰基，得殼聚糖。

1.2.2 甲殼低聚糖的制備[9]

取殼聚糖按比1∶30（W/V）比例加入到2%乙酸溶液中，振搖，使其完全溶解呈均相狀態(tài)。在80℃條件下滴加濃度為3%的H2O2溶解的殼聚糖中1 h，邊滴邊攪拌，滴加完畢繼續(xù)反應2 h，H2O2量與殼聚糖乙酸溶液量比例為1∶5。用2 mol/l NaOH溶液將反應液pH調(diào)到10，濾液加3倍量乙醇（體積分數(shù)），放置過夜，抽濾，經(jīng)30℃真空干燥得甲殼低聚糖。

1.2.3 氨基葡萄糖鹽酸鹽的制備[10]

稱取0.3 g殼聚糖，溶于100 mL 1%（體積分數(shù)）的醋酸溶液中，用攪拌使其充分溶解，按殼聚糖與鹽酸溶液1∶7的比例加入15%鹽酸水解3 h，過濾，得氨基葡萄糖鹽酸鹽粗品溶液。

取氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液加入質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇調(diào)節(jié)乙醇終濃度至75%，搖勻后靜止放置12 h后析出沉淀，過濾，得淡黃色氨基葡萄糖鹽酸鹽粗品。粗品用蒸餾水溶解，過濾，加丙酮重結(jié)晶3次。

將上述得到的結(jié)晶狀物用蒸餾水溶解，按質(zhì)量濃度0.1%的比例加入活性炭，攪拌，然后抽濾，得到透明澄清的濾液，濾液濃縮后加入丙酮，沉淀過濾、干燥，得到白色晶體狀氨基葡萄糖鹽酸鹽。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）及抑菌活性的測定[11]

定量稱取無菌甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽，溶于1%的醋酸溶液使成1%（w/v）的溶液，然后加入到MH瓊脂菌懸液中，使其最終濃度分別為0.1%、0.08%、0.05%、0.01%、0.005%、0.003%（w/v），然后于搖床37℃培養(yǎng)一定時間。于640 nm測定菌懸液濁度來確定抑菌效果，MIC定義為完全抑制細菌生長的最低濃度。陰性對照組為取1%的醋酸溶液加入到MH瓊脂菌懸液中，然后于搖床37℃培養(yǎng)。

以吸光度值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制不同樣品的時間-吸光度曲線（生長曲線）。

1.2.5 殼聚糖脫乙酰度的測定

采用文獻[12]的方法，以甲基橙-苯胺藍為指示劑，用NaOH標準溶液滴定，根據(jù)NaOH的量即可算出樣品的脫乙酰度（DD）。

1.2.6 甲殼素與殼聚糖的黏均分子量的測定

采用黏度法[7]。甲殼素的溶劑采用二甲乙酰胺，殼聚糖的溶劑為用0.2 mol/L乙酸-0.3 mol/L乙酸鈉溶液，在30℃的恒溫水槽中進行。相對分子質(zhì)量的計算用Mark-Houwink經(jīng)驗公式：

式中：[η]為黏度，甲殼素常數(shù)K為1.81×10-3mL/g，α為0.93。

1.2.7 甲殼低聚糖分子量測定

以氨基葡萄糖為標準品，以DNS試劑為反應試劑，于520 nm處測定吸光度值，按文獻[13]方法計算甲殼低聚糖分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 所得樣品性質(zhì)

試驗中所得的甲殼素的經(jīng)測定黏均分子量為41× 104U，脫乙酰度為32%。殼聚糖的黏均分子量5×104U，脫乙酰度為75%。甲殼低聚糖均分子量為2 100 U。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽的最低抑菌濃度見表1。

表1 最低抑菌濃度（MIC）Table 1 Minimum inhibitory concentration（MIC）%

甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對測試菌種的MIC比甲殼素、殼聚糖要低。甲殼素、殼聚糖對不同的菌株的MIC有著較大的差異，對綠膿假單胞菌、沙門氏菌的MIC大于等于0.1%，甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所有測試菌株的MIC均較小，說明甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所測試菌株比甲殼素、殼聚糖表現(xiàn)出更高的抑菌活性。

4種抑菌物對G-菌的MIC值統(tǒng)計分析表明，甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽的抑菌性能與甲殼素、殼聚糖的抑菌性能具有極顯著差異（p＜0.01），對G+中的金黃色葡萄球菌具有極顯著差異（p＜0.01），但是對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌，4種抑菌物都表現(xiàn)出了一定的抑菌性能，彼此不存在顯著性差異。

2.3 各樣品的抑菌效果

2.3.1 對G+的抑制效果

0.1%（w/v）的甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G+菌的抑菌特性見圖1、圖2、圖3。

圖1 金黃色葡萄球菌Fig.1 Staphylococcus aureus

圖2 蠟樣芽孢桿菌Fig.2 Bacillus cereus.Frankland

圖3 枯草芽孢桿菌Fig.3 Bacillus subtilis

橫坐標為菌種培養(yǎng)時間，縱坐標為640 nm處吸光度，吸光度值越小表明抑菌效果越好。

從圖1中可以看出，陰性對照組中金黃色葡萄球菌生長很迅速，在培養(yǎng)5 h后達到穩(wěn)定期，其吸光度為0.54。加入樣品的實驗菌株生長緩慢，含有0.1%的甲殼素和0.1%的殼聚糖的兩組實驗在8 h達到穩(wěn)定生長期，吸光度值分別為0.40、0.37，說明甲殼素與殼聚糖對金黃色葡萄球菌的生長有一定的抑制作用。甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽表現(xiàn)出相對較強的抑制活性，甲殼低聚糖組在3 h達到最大吸光度值，且吸光度值僅為0.18，氨基葡萄糖鹽酸鹽組先有一定的生長，到2 h時，吸光度值降低，然后趨于0，說明該組的實驗菌株的生長完全被抑制。

由圖2、圖3可以看出，0.1%的殼聚糖能抑制64%的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，說明桿菌屬對殼聚糖比較敏感，與文獻[13]報道的一致。甲殼素、甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽對桿菌屬也有一定的抑制作用。

2.3.2 對G-的抑制效果

0.1%（w/v）的甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽的對幾種G-菌的抑菌特性見圖4、圖5、圖6。

圖4 大腸桿菌Fig.4 Escherichia coli

圖5 沙門氏菌Fig.5 Salmonella

圖6 綠膿假單胞菌Fig.6 Pesudomonas pyocyaneum

陰性對照組的細菌數(shù)量隨著時間的增加而迅速增加，培養(yǎng)4 h后就達到了穩(wěn)定期。甲殼素與殼聚糖對大腸桿菌有一定的抑制作用，約在4 h后達到穩(wěn)定期，最大吸光度值為0.3、0.24，甲殼素和殼聚糖對大腸桿菌的抑制25%，對綠膿假單胞菌的抑制作用較弱，由圖5可以看出，甲殼素組、殼聚糖組與對照組的曲線基本重合，說明甲殼素、殼聚糖對沙門氏菌基本沒有抑制作用。0.1%的甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G-菌的抑制作用較強，4 h后吸光度值迅速降近0，甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽的抑菌活性比甲殼素和殼聚糖高，氨基葡萄糖鹽酸鹽為較有效的抑菌劑。

由結(jié)果可以看出，甲殼素與殼聚糖對大部分試驗菌都有一定的抑制作用，但是，不能完全抑制試驗菌的生長，存活的細菌會繼續(xù)繁殖。殼聚糖的抗菌活性強于甲殼素，尤其是對G-菌，可能是由于殼聚糖有許多陽離子胺基可以與細菌細胞表面的多糖、脂類及蛋白質(zhì)的陰離子基團結(jié)合從而抑制微生物的生長。其抑菌機理可能為其會導致菌體絮凝然后使其因為缺少營養(yǎng)及氧氣從而使細菌死亡。然而，在本實驗濃度下，殼聚糖與甲殼素不能把所有的細菌都殺滅，另外，如果殼聚糖的分子量小，其聚合鍵可以與多個細胞結(jié)合。由此，細菌細胞與殼聚糖聚合物鏈橋可以很容易的建立，從而使細菌迅速滅活。甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽可作為殺菌劑[13]。低聚糖可能能透過細菌的細胞壁，殼聚糖對細菌的抑制作用跟劑量有關。

3 結(jié)論

1）甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所有測試菌株的MIC均較小，說明甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所測試菌株比甲殼素、殼聚糖表現(xiàn)出更高的抑菌活性。

2）甲殼素、殼聚糖對G+菌都表現(xiàn)出一定的抑菌性能，0.1%的殼聚糖能抑制64%的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，說明桿菌屬對殼聚糖比較敏感，甲殼低聚糖對G+菌都表現(xiàn)出較強的抑菌作用，氨基葡萄糖鹽酸鹽能完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。

3）甲殼素和殼聚糖對大腸桿菌、綠膿假單胞菌有一定的抑制作用，對沙門氏菌基本沒有抑制作用。0.1%的甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G-菌的抑制作用較強，氨基葡萄糖鹽酸鹽為較有效的抑菌劑。

4）甲殼素和殼聚糖可作為較有效的抑菌劑，甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽可作為幾種受試G-菌的殺菌劑。

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Preparation and Antibacterial Activity of Chitin and Its Derivatives

YIN Xiu-lian1，2，YOU Qing-hong1，2，3，ZHOU Xing-hai1
（1.Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration；Huaiyin Institute of Technology，Huaian 223001，Jiangsu，China；2.Huaian High-Tech Research Institute of Nanjing University，Huaian 223001，Jiangsu，China；3.Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology，Huaian 223300，Jiangsu，China）

The antimicrobial activities of chitin，chitosan isolated from shrimp shell waste and their derivate chito-oligosaccharides，glucosamine hydrochlorid against three Gram-positive and three Gram-negative bacteria were studied.Results of MIC experiments showed that the MIC of chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid were all＜0.01%，their antimicrobial activities were higher than that of chitin and chitosan.Through growth curve，the antimicrobial activities were studied.Results showed that chitosan of 0.1%could inhibit 64% Bacillus subtilis and Bacillus cereus，which demonstrated that Bacillus are more sensitive to chitosan.Chitooligosaccharides showed strong antimicrobial activities to all Gram-positive bacteria.Gucosamine hydrochlorid could inhibit the growth of Staphylococcus aureus completely.Chitin and chitosan showed some inhibit activity on Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa，but have no effect on Salmonella typhi. chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid of 0.1%had strong inhibit effect on all three Gramnegative bacteria.Chitin and chitosan can be used as effective bacterial inhibitor，chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid can be used as bacteriocide of the three Gram-negative bacteria used in the experiments.

chitin；chitosan；chito-oligosaccharides；glucosamine hydrochlorid；antimicrobial activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.004

2013-05-30

江蘇省科技廳資助項目（No.BN2011008）；江蘇省教育廳資助項目（No.12KJB480003）；江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點實驗室開放課題（No.JSBEET1203）

尹秀蓮（1978—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：天然活性成分分離及應用。