狗食管下括約肌處射頻控溫熱凝術后病理學及神經遞質變化的研究

周曉丹王洪濤△劉義賓汪忠鎬

狗食管下括約肌處射頻控溫熱凝術后病理學及神經遞質變化的研究

周曉丹1王洪濤1△劉義賓1汪忠鎬2

目的探討射頻控溫熱凝術（RFT）對家狗食管下括約肌（LES）處病理組織及神經遞質膽堿乙酰轉移酶（ChAT）、血管活性腸肽（VIP）和一氧化氮合酶（NOS）表達的影響及可能機制。方法15只家狗隨機分為3組：進行胃鏡檢查并飼養3個月（Sham）組、RFT后飼養24 h（RFT+24 h）組、RFT后飼養3個月（RFT+3 m）組。取LES組織采用HE染色法觀察3組的病理組織學變化，免疫組化法觀察Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP和NOS的表達情況。結果HE染色結果顯示Sham組接近正常組織，RFT+24 h組黏膜出現急性炎癥反應和結構破壞，RFT+3 m組黏膜出現慢性炎性反應和結構重構；免疫組化結果顯示RFT+3 m組與Sham組相比，ChAT明顯升高，VIP、NOS明顯下降（均P＜0.01）。結論RFT可使狗的LES厚度和壓力增加，并造成局部組織內神經遞質發生表達變化。

胃食管反流；食管括約肌,下段；膽堿O-乙酰轉移酶；血管活性腸肽；一氧化氮合酶；狗；射頻控溫熱凝術；食管下括約肌；膽堿乙酰轉移酶

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease, GERD）的內鏡下射頻治療(Stretta)在國內最早由劉建軍等報道[1]，其操作安全，并發癥少，可以重復治療，對于藥物治療無效的頑固性患者或伴隨食管外癥狀患者有其獨特療效，目前，在國內應用較為廣泛。射頻治療的作用機制主要為術后使食管下括約肌（lower esophageal sphincter,LES）壓力增高和術后的一過性LES松弛（transit LES relaxation,tLESR）的頻率降低。術后LES的壓力增高可通過射頻后局部病理組織學變化和食管壓力的測定評估，然而，射頻治療降低tLESR的機制尚不明確。本研究通過觀察狗LES在射頻控溫熱凝術（radiofrequency thermocoagulation,RFT）后的病理組織學和部分神經遞質的表達變化，以期進一步探討RFT在治療胃食管反流病方面的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物普通家狗15只，清潔級，體質量（10±2）kg，雌雄不限，剔除妊娠狗，均購自山東魯抗醫藥股份有限公司駐河南飼養動物室（生產許可證號：SCXK魯20080002）。按隨機區組法將動物隨機分為3組，每組5只，分別為：僅行胃鏡檢查并飼養3個月后處死(Sham組),行RFT并24 h后處死（RFT+24 h組）,行RFT并飼養3個月后處死（RFT+3 m組）。

1.2 主要試劑和儀器麻醉藥：速眠新Ⅱ號（吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司）；促蘇醒藥：蘇三號（吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司）；DFX-23D型電動吸引器（上海科凌醫療器械有限公司）；MER-200GA射頻控溫熱凝器（哈爾濱美頓醫療器械有限公司）；EPX-2200電子胃鏡（日本富士能株式會社）。兔抗人膽堿乙酰轉移酶（ChAT）多克隆抗體、兔抗人血管活性腸肽（VIP）多克隆抗體、兔抗人一氧化氮合酶（NOS）多克隆抗體和SABC試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Biosens Digital Imaging System V1.6圖像分析軟件購自上海山富科學儀器有限公司。

1.3 標本制備（1）術前禁食24 h（不禁水），藥物促排糞便。（2）0.5 mL/kg速眠新Ⅱ號肌內注射，麻醉成功后，固定于操作臺上，取左側臥位，開口器固定。（3）Sham組插入胃鏡觀察食管、胃內情況，測量門齒距胃食管連接處距離，拔出胃鏡。（4）RFT+24 h組和RFT+3 m組均于胃鏡觀察、測量門齒距胃食管連接處距離后，沿導絲插入治療導管，拔出胃鏡，自胃食管連接處向食管遠心端選取3個層面、每個層面間隔0.5 cm。設定射頻控溫熱凝治療器輸出功率5 W，治療時間60 s。每個層面治療2次，每次4個治療點，共8個點。每次治療結束后，抽盡導管氣囊空氣，收回射頻電極，將導管插入胃腔，旋轉45°，再次置于治療層面，進行第2次治療。每只動物治療24個點。（5）待實驗結束后切取所有動物食管下段、齒狀線上3 cm食管組織常規固定、取材，石蠟包埋。

1.4 病理學觀察將標本行連續的5μm切片，常規脫蠟并行HE染色，光鏡下觀察，按新悉尼系統病理積分將不同的炎癥反應、組織結構變性分為0～3分，共計15分。

1.5 神經遞質檢測采用免疫組化SP法。所取標本均經10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，經5μm連續切片，常規脫蠟至水化，微波法抗原修復，3％過氧化氫孵育10 min滅活內源性過氧化物酶，依次滴加正常山羊血清工作液封閉，滴加一抗工作液，滴加生物素化二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素液復染，脫水、透明、封片。細胞膜、漿或細胞間隙呈棕黃色為陽性細胞。半定量法結果判定：在400倍光鏡下隨機讀取10個視野，計數每視野表皮100個有核細胞中陽性細胞數，取其平均數。

1.6 統計學方法采用SPSS 17.0進行統計處理，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法,2組獨立樣本的比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 病理學表現及積分比較Sham組接近正常組織，RFT+24 h組表面鱗狀上皮、固有層及部分黏液腺結構缺損，中性粒細胞和部分淋巴細胞浸潤食管壁全層，黏膜出現不同程度的以急性為主的炎癥反應和結構破壞，RFT+3 m組可見伴有慢性炎性反應的結構重構，主要表現為表面鱗狀上皮輕度增厚，固有層增厚，纖維結締組織增生，膠原變性，慢性炎細胞浸潤，見圖1。Sham組、RFT+24 h、RFT+3 m病理積分依次為1.00±0.31、3.00±0.31、6.20±0.66，差異有統計學意義（F=32.250，P＜0.01），RFT+24 h組高于Sham組，RFT+3 m組高于RFT+24 h組（均P＜0.05）。

2.2Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP和NOS表達情況的比較與Sham組相比，RFT+3 m組ChAT的表達升高，VIP和NOS的表達下降（均P＜0.01），見圖2，表1。

Tab.1 Comparison of ChAT，VIP and NOS at LES between three groups表1 LES處Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP、NOS表達情況的比較（n=5,個/HP）

3 討論

射頻治療已廣泛應用于臨床治療[2]。當射頻電流經過人體組織時,因電阻損耗而轉化為熱能，使病變部位升溫，細胞內外水分蒸發、干燥、固縮以至無菌壞死，從而達到治療目的。文獻報道射頻方法治療GERD的主要機制分為兩種[3]。第一，通過熱能引起LES的破壞、再生,誘導膠原組織收縮、重構，從而增加LES厚度和壓力，增加抗反流屏障；第二，射頻治療能破壞食管肌層內迷走神經節，阻斷tLESR。本研究顯示射頻治療可引起LES的表面鱗狀上皮輕度增厚、固有層增厚、纖維結締組織增生、膠原變性以及慢性炎細胞浸潤等變化，進一步印證了射頻治療能夠通過增加LES的厚度和壓力來發揮抗反流屏障的作用。

然而，對于射頻治療可造成LES處的迷走神經損傷，減少tLESR[4]這一說法尚無明確的科學根據。有文獻報道，tLESR是由迷走-迷走神經反射介導的[5]，而吞咽時誘發的LES松弛、胃張力減低和容受性舒張均是由迷走神經介導的。又有文獻推測，胃擴張誘發tLESR的神經傳遞途徑為:胃壓力感受器→迷走神經→孤束核→迷走神經背核→迷走神經→LES[6-7]。因此，從以上文獻可以推測，迷走神經功能紊亂和tLESR增多是GERD發生的重要機制。

乙酰膽堿(Ach)是控制LES收縮的最主要的神經遞質[8]。近年來，免疫細胞化學技術的發展使人們能利用Ach的合成酶—ChAT來檢測和顯示組織中存在的Ach[9]；一氧化氮(NO)是胃腸道包括LES最主要的抑制性非膽堿能非腎上腺素能(NANC)神經遞質[10]，可通過激活蛋白激酶G(PKG)引起平滑肌的舒張[11]；VIP具有強烈的擴張周圍及內臟血管的作用，作為NANC神經的主要遞質，在消化道廣泛存在，對消化道運動起抑制性調節作用，VIP抗體能阻斷電刺激和迷走反射所引起的平滑肌收縮[12]。

本研究結果顯示，對狗LES處進行RFT治療并飼養3個月后可造成ChAT增多，VIP和NOS減少，由此推測：臨床應用RFT治療GERD，能夠刺激食管肌層內迷走神經節,分別引起Ach釋放增多和VIP、NO的釋放減少，從而調整其功能紊亂，阻斷或減少tLESR，使GERD得以控制。

本次實驗并未觀察RFT+24 h組ChAT、VIP和NOS的表達情況，因而不了解RFT后急性期神經遞質的表達變化，將會在后續研究中將此項內容列入觀察范圍。總之，針對RFT通過調節迷走神經功能紊亂來治療胃食管反流病的機制有待進一步研究。

Fig.1 Pathological features of LES under light microscopy（HE,×100）圖1 各組病理切片LES光鏡下表現（HE,×100）

Fig.2 Expressions of ChAT，VIP and NOS at LES in two groups（SP，×400）圖2 LES處Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP、NOS的表達（SP，×400）

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[2]汪忠鎬，劉建軍，陳秀，等.胃食管喉氣管綜合征(GELTS)的發現與命名—Stretta射頻治療胃食管反流病200例[J].臨床誤診誤治，2007,20（5）：1-4.

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（2013-10-21收稿2014-01-03修回）

（本文編輯李國琪）

Study on Pathology and Neurotransmitters of Esophageal Sphincter after Radiofrequency Thermocoagulation in Dogs

ZHOU Xiaodan1,WANG Hongtao1,LIU Yibin1，WANG Zhonggao2
1Department of Gastroenterology,The Fourth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Henan 450000,China; 2Gastroesophageal Reflux Disease Center,The Second Artillery General Hospital
WANG Hongtao,E-mail:wht1962@yeah.net

ObjectiveTo investigate the effects of radiofrequency thermocoagulation(RFT)on pathological features and the expressions of choline acetyltransferase(ChAT),vasoactive intestinal peptide(VIP)and nitric oxide synthase(NOS) at lower esophageal sphincter(LES)in family dogs.MethodsA total of 15 dogs were randomly divided into three groups. Sham group underwent gastroscopy and was fed for 3 months(n=5).Dogs were given RFT and were fed for 24 h after RFT(n= 5,RFT+24 h group).Dogs were given RFT and were fed for 3 months after RFT(n=5,RFT+3m group).The pathological changes of LES were observed after HE staining in three groups.The expressions of ChAT,VIP and NOS were detected by immunohistochemical method in three groups.ResultsResultsof HE staining showed nearly the same tissues in Sham group and control group.There were active inflammatory reaction and structural damage in RFT+24 h group.The chronic inflammatory reaction and structural remodeling were found in RFT+3m group.Immunohistochemistry showed that ChAT was significantly increased in RFT+3m group compare than that of Sham group.Values of VIP and NOS were significantly decreased in RFT+3m group compare than that of Sham group(P＜0.01).ConclusionThe thickness and increased pressure of LES were found after RFT，which also caused changes in neurotransmitters of local tissues in dogs.

gastroesophageal reflux;esophageal sphincter,lower;choline O-acetyltransferase;vasoactive intestinal peptide;nitric oxide synthase;dogs;radiofrequency thermocoagulation;lower esophageal sphincter;choline acetyltransferase

R571

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.011

1鄭州大學第四附屬醫院消化內科（郵編450000）；2第二炮兵總醫院胃食管反流病中心

△通訊作者E-mail:wht1962@yeah.net