氯吡格雷預處理對膿毒癥大鼠心肌損傷保護作用及機制的研究

李妮妮，符基定，陳威丞，芮 蕾，溫漢春，朱繼金

（廣西醫科大學第一附屬醫院1.心血管研究所；2.急診科，廣西 南寧 530021）

氯吡格雷預處理對膿毒癥大鼠心肌損傷保護作用及機制的研究

李妮妮1，符基定1，陳威丞1，芮 蕾2，溫漢春2，朱繼金2

（廣西醫科大學第一附屬醫院1.心血管研究所；2.急診科，廣西 南寧 530021）

目的 探討氯吡格雷干預對血小板聚集及膿毒癥心肌損傷的影響及膿毒癥時心肌損傷與血小板的聚集的關系。方法取Wistar雄性大鼠72只，隨機分成3組：正常對照組（NC組），內毒素組（ET組），氯吡格雷+內毒素組（CL+ET組）。CL +ET組預先給予氯吡格雷3 d后，腹腔注射LPS（10 mg·kg-1）建立急性膿毒癥心肌損傷模型。在0、6、12 h采血檢測血小板聚集率、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）；酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清、心肌中 TNF-α的表達水平；檢測心臟干濕重比；取心肌標本，行 HE染色，光鏡觀察大鼠心肌結構改變。結果 與 NC組相比，注射 LPS后 ET組血小板聚集率更高（P＜0.05），且隨時間延長而增加［（27.78±1.01）、（32.41±3.04）、（50.99±14.35）ohm］；CL+ET組預先給予氯吡格雷處理后，血小板聚集率處于抑制狀態（P＜0.05）。CL+ET組較 ET組，在相應時點對內毒素誘導的 cTnI、血清及心肌 TNF-α水平升高有明顯的抑制作用（P＜0.05）；心肌干濕重比有差異（P＜0.05）。ET組 LPS注射6 h后心肌出現炎癥細胞浸潤、纖維腫脹、排列紊亂，12 h最顯著；與ET組比較，CL+ET組在相應時點對心肌炎癥細胞浸潤和心肌纖維腫脹程度減輕。結論 LPS引起的心肌損傷過程中血小板聚集明顯，氯吡格雷阻斷血小板 P2Y12受體，抑制血小板聚集，對 LPS引起的心肌損傷具有一定的抑制作用。

膿毒癥；心肌損傷；氯吡格雷；血小板；P2Y12受體

膿毒癥（sepsis）是感染、嚴重創傷、燒傷、外科大手術后常見的并發癥，病情進一步發展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（MODS）、甚至死亡；若合并心肌損傷，病死率將顯著增加［1］。在膿毒癥心肌損傷的發生機制中，炎癥反應及其中心介質TNF-α具有重要作用。此外，膿毒癥存在炎癥系統與凝血系統的交叉反應。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起血小板活化后，發生聚集、釋放反應和血栓形成，可促進炎癥反應進程，加重炎癥反應。大量資料表明，膿毒癥發病過程中的血小板活化普遍存在［2-3］。然而，通過抑制血小板活化，能否減低膿毒癥心肌損傷研究報道較少，值得進一步探討。本實驗通過建立大鼠急性膿毒癥心肌損傷模型［4］，觀察大鼠血小板聚集率、cTnI、血清及心肌組織TNF-α、心肌干濕重比的變化及光鏡下 HE染色病理切片形態學改變，旨在研究氯吡格雷是否通過抑制血小板聚集發揮對膿毒癥大鼠心肌損傷保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要儀器試劑 健康 Wistar雄性大鼠72只，體重（220±30）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK桂2009-0002。LPS（Sigma公司，美國，批號：L 2880）；氯吡格雷（商品名：波立維，賽諾菲公司，法國，批號：國藥準字J20080090）；大鼠腫瘤壞死因子 α（TNF-α）Elisa試劑盒（上海瑞齊生物科技有限公司，96T）。血小板聚集儀（全血發光血小板聚集系統，Chrono-Log公司，美國），全自動免疫分析儀（ARCHITECT-i2000SR，雅培公司，美國），熒光相差顯微鏡成像分析系統（日本OLYMPUS）。

1.2 實驗方法及步驟 大鼠適應性飼養 1周，隨機均分為3組：即正常對照組（NC組），內毒素組（ET組），氯吡格雷+內毒素組（CL+ET組）。每組再隨機分為0、6、12 h 3個觀察時間點，每個時間點8只大鼠。ET組和 CL+ET組分別腹腔注射LPS （10 mg·kg-1），建立急性膿毒癥心肌損傷大鼠模型［4］。NC組腹腔注射生理鹽水1 mL。CL+ET組于 LPS注射前 3 d胃灌注氯吡格雷（200 mg·kg-1·d-1）。3組分別于注射 0、6、12 h取血清及心臟組織送檢。

1.2.1 血小板聚集率檢測 分別于0、6及12 h用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔內注射麻醉，無菌操作下打開腹腔，取腹主動脈內全血2 mL，抗凝，采用全血法檢測內毒素注射后不同時間點大鼠的血小板聚集率。

1.2.2 血清cTnI和TNF-α檢測 不同時間點大鼠麻醉、開腹后，經腹主靜脈下取全血 4 mL，分裝 2管，不抗凝。化學發光酶免疫分析法檢測 cTnI；另一管進行低溫高速離心處理（14 000 r·min-1）15 min，保留上清液，（TNF-α）ELISA試劑盒檢測TNF-α表達水平。

1.2.3 光鏡標本制作 打開大鼠胸腔，迅速取下心臟，以4℃冰生理鹽水洗凈，去除大血管及結締組織，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm透壁心肌組織置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下組織形態學觀察。

1.2.4 心肌 TNF-α檢測 取 100 mg心肌，以 4℃冰生理鹽水洗凈，用手術剪將組織剪碎，勻漿器勻漿，3 000 r·min-1離心 15 min，取上清液。根據試劑盒說明操作，（TNF-α）ELISA試劑盒檢測TNF-α表達水平。

1.2.5 心肌干濕重比 取左心室用濾紙吸去表面水分，稱重，即濕重。80℃烘箱干燥 12 h至恒重后取出稱重，即干重。計算心肌干濕重比。心肌干濕重比＝干重／濕重。

1.3 統計學分析 采用SPSS 16.0統計軟件分析數據。所有計量資料用均數 ±標準差（±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用 LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為表現 NC組大鼠毛發光澤度好、活動力強、刺激反應靈敏。ET組 LPS注射20 min后，大鼠活力減弱、刺激反應減弱；1 h后，出現少動，群居，反應差；3 h后，毛發光澤度減弱、進食減少；12 h部分大鼠出現抽搐現象，對刺激反應弱。CL+ET組灌胃給予氯吡格雷后行為表現與 NC組無差異；LPS注射 6 h后，大鼠活動力減弱、刺激反應減弱；12 h進食減少。

2.2 光鏡下心肌纖維改變 NC組：心肌纖維完整，排列整齊，纖維互聯呈網狀，細胞核清晰，核膜完整，見圖1；ET組0 h、CL+ET組0 h、CL+ET組6 h的心肌形態與NC組基本相似；ET組 6 h心肌纖維腫脹，排列整齊度降低，見圖2；ET組12 h心肌形態：心肌纖維腫脹，少量溶解，胞質淡染，出現炎癥細胞，見圖3；CL+ET組12 h心肌形態：心肌纖維稍腫脹，出現炎癥細胞，見圖4。

表1 不同時間點血清 cTnI水平變化的組間比較（±s，n＝8，μg·L-1）

表1 不同時間點血清 cTnI水平變化的組間比較（±s，n＝8，μg·L-1）

注：與NC組比較，*P＜0.05；CL+ET組與ET組比較，▲P＜0.05。

組別0.031±0.016 0.028±0.016 0.030±0.015 ET組 0.032±0.014 0.376±0.044*0.990±0.493*CL+ET組 0.025±0.019 0.033±0.021▲0.036±0.021 0 h 6 h 12 h NC組▲

2.3 各組血清 cTnI比較 0 h：3組 cTnI水平無統計學差異。6 h及12 h：ET組 cTnI水平顯著增高于其他兩組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而NC組與 CL+ET組 cTnI水平差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

注：圖1 NC組大鼠心肌橫紋肌 （HE染色，×400）；圖2 ET 組6h大鼠心肌橫紋肌（HE染色，×400）；圖3 ET組12 h大鼠心肌橫紋肌（HE染色，×400）；圖4 CL+ET組12 h大鼠心肌橫紋肌（HE染色，×400）；箭頭指向炎癥細胞。

2.4 各組大鼠心肌干濕重比較 0 h、6 h：3組心肌干濕重比無統計學差異（P＞0.05）。12 h：ET組心肌干濕重比水平低于其他兩組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而NC組與CL+ET組心肌干濕重比差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 不同時間點心肌干濕重比水平變化的組間比較（±s，n＝8）

表2 不同時間點心肌干濕重比水平變化的組間比較（±s，n＝8）

注：與NC組比較，*P＜0.05；CL+ET組與ET組比較，▲P＜0.05。

0.218 8±.002 2 0.218 9±.002 2 0.219 3±.002 4 ET組 0.219 3±.001 8 0.218 3±.002 3 0.216 0±.001 5*CL+ET組 0.218 5±.001 4 0.219 0±.002 7 0.218 4±.0011 0 h 6 h 12 h NC組組別▲

表3 不同時間點血小板聚集率變化的組間比較（±s，n＝8，ohm）

表3 不同時間點血小板聚集率變化的組間比較（±s，n＝8，ohm）

注：與NC組比較，*P＜0.05；CL+ET組與ET組比較，▲P＜0.05。

27.53±1.56 27.83±2.29 27.28±1.57 ET組 27.78±1.01 32.41±3.04*50.99±14.35*CL+ET組 7.99±1.17*▲10.39±1.71*▲10.51±2.46 0 h 6 h 12 h NC組組別*▲

2.5 各組血小板聚集率比較 0 h的 CL+ET組血小板聚集率明顯低于其他兩組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而 NC組與 ET組血小板聚集率差異無統計學意義（P＞0.05）。6 h、12 h：3組血小板聚集率有統計學差異（P＜0.05），且兩兩比較均有統計學差異（P＜0.05）。詳見表3。

2.6 各組血清及心肌 TNF-α水平比較 0 h的 3組血清及心肌 TNF-α表達水平無統計學差異（P＞0.05）。6 h、12 h：3組血清及心肌 TNF-α表達水平有統計學差異（P＜0.05），且兩兩比較均有統計學差異（P＜0.05）。詳見表4，5。

表4 不同時間點血清 TNF-α水平變化的組間比較（±s，n＝8，ng·L-1）

表4 不同時間點血清 TNF-α水平變化的組間比較（±s，n＝8，ng·L-1）

注：與 NC組比較，*P＜0.05；CL+ET組與ET組比較，▲P＜0.05。

34.47±12.47 37.62±17.60 37.13±11.74 ET組 39.46±17.50 277.97±12.01*449.08±31.28*CL+ET組 31.39±17.23 85.38±9.03*▲138.26±23.14 0 h 6 h 12 h NC組組別*▲

表5 不同時間點心肌 TNF-α水平變化的組間比較（±s，n＝8，ng·L-1）

表5 不同時間點心肌 TNF-α水平變化的組間比較（±s，n＝8，ng·L-1）

注：與NC組比較，*P＜0.05；CL+ET組與ET組比較，▲P＜0.05。

29.36±6.64 33.41±5.03 32.22±5.94 ET組 34.53±6.80 164.86±13.09*238.50±23.63*CL+ET組 32.87±7.67 65.07±14.42*▲111.82±7.69 0 h 6 h 12 h NC組組別*▲

3 討論

膿毒癥是指由感染或有高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應綜合征 （SIRS），引起膿毒癥最有代表性的毒素為革蘭陰性細菌內毒素（主要成分為脂多糖即 LPS）。膿毒癥合并心肌損傷常常導致膿毒癥休克及多臟器功能衰竭，病情兇險，病死率高。本研究發現：ET組大鼠血清及心肌組織中 TNF-α水平升高，與血清 cTnI升高時間一致，提示 LPS可誘導炎癥因子釋放，導致炎癥細胞浸潤，最終引起心肌損傷。氯吡格雷預處理后可降低 TNF-α水平，能抑制心肌組織中炎癥細胞的浸潤，對 LPS引起的大鼠心肌損傷產生保護作用。

近年來，隨著人們對膿毒癥機制認識的加深，發現血小板活化在膿毒癥炎癥易化及進展中起關鍵作用。本實驗結果顯示，LPS刺激后ET組血小板聚集率顯著升高，并且在相應的時點炎癥因子TNF-α及心肌酶cTnI上升明顯，心肌組織水腫，提示心肌損傷。國內外研究亦證實活化的血小板導致炎癥的擴大。大量研究發現［3］，活化的血小板可以誘導中性粒細胞過度活化，產生增強的前炎癥因子 TNF-α釋放，擴大炎癥反應，導致心肌細胞損傷。另外，活化的血小板可以通過 CD40L與 CD40結合，誘導內皮細胞分泌某些細胞因子并表達多種黏附分子，對炎癥部位有關填充與滲出的信號途徑進行調節［5-6］。活化的血小板還可表達IL-1，胞分泌相關的趨化因子，最終導致白細胞向炎癥區域游走［7］。P-選擇素（CD 62）在活化的血小板表面表達，它可以作用于白細胞 CD 11b／CD 18（Mac-1）［8-9］，促進后者與纖維蛋白原-GPⅡb／Ⅲa接合，增加白細胞與血小板的黏附。

LPS可以刺激 TNF-α、IL-1和 IL-6等炎癥因子大量表達［10］，引發失控的炎癥反應，其中 TNF-α是炎癥瀑布級聯反應的關鍵。TNF-α可以通過多種途徑損傷心肌：（1）TNF-α誘導心肌細胞程序性死亡；（2）TNF-α激活炎癥細胞，使其黏附于心肌細胞和內皮細胞上，導致心肌受損；（3）TNF-α誘導NO產生，造成心肌損傷；（4）TNF-α負性肌力作用［11］。同時，受損的心肌是TNF-α生物合成場所，可以產生大量TNF-α，進一步加重心肌損害。實驗結果發現，ET組6 h、12 h心血清和心肌中 TNF-α水平均明顯升高，與血清 cTnI升高時間一致。研究資料提示，兩者間存在高度相關性［12-13］。因此推斷，大量TNF-α產生對心肌產生抑制作用。

本實驗發現，氯吡格雷可以降低 LPS處理后血清及心肌升高的炎癥因子TNF-α水平，減輕炎癥反應。研究表明，血小板的活化程度不足，將難以引發進一步的白細胞活化和炎癥因子增多，炎癥反應程度減輕［14］。血小板聚集是其活化的重要組成部分，GPⅡb／Ⅲa作為纖維蛋白原受體，介導血小板聚集的最終途徑。氯吡格雷是臨床上常用的抑制血小板聚集藥，其活性代謝產物可以與血小板表面二磷酸腺苷（ADP）受體 P2Y12不可逆地結合，使ADP結合位點大幅度減少，腺苷環化酶被抑制，依賴腺苷酸環化酶的磷酸蛋白的磷酸化加劇，阻礙纖維蛋白原與血小板糖蛋白 GPⅡb／Ⅲa受體結合及繼發的ADP介導的糖蛋白 GPⅡb／Ⅲa復合物的活化，進而抑制血小板的聚集，控制血小板活化［15-16］。本實驗結果表明，CL+ET組血小板聚集受抑制，在6、12 h的心肌和血清中TNF-α表達水平較ET組低，并且cTnI量亦減少。HE染色病理切片觀察到，在相應時點CL+ET組較ET組心肌損傷程度減輕。提示氯吡格雷預處理后，抑制血小板聚集及活化，可以降低膿毒癥大鼠心肌組織中炎癥因子 TNF-α的水平，能明顯抑制心肌組織中炎性細胞的大量浸潤，產生心臟保護作用。

綜上所述，血小板活化在炎癥反應發生、發展中起關鍵作用，可導致心肌損傷進一步加重。氯吡格雷可以阻斷ADP-P2Y12-GPⅡb／Ⅲa信號轉導通路，抑制血小板活化，控制炎癥反應擴大，減輕心肌損傷。這將為膿毒癥的治療提供重要的指導作用。

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Myocardial protective effects of clopidogrel preconditioning in septic rats

LI Ni-ni，FU Ji-ding，CHEN Wei-cheng，et al
（Institute of Cardiovascular Diseases，the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

Objective To explore the effect of clopidogrel preconditioning on platelet aggregation and myocardial injury，so as to investigate the relationship of platelet aggregation and myocardial injury in sepsis.Methods Seventy-two Wistar rats were randomly assigned into three groups：normal control group（NC，n＝24），endotoxin group（ET，n＝24），clopidogrel pretreatment and endotoxin group（CL +ET，n＝24）.Rats in ET group and CL+ET group were injected intraperitineally with LPS（10 mg·kg-1） to establish an acute cardiac injury model，then continuous intragastric administration of clopidogrel were administered for three days.Each group was observed at three time point（0，6，12 h，n＝8）.Platelet aggregation was tested with impedance platelet aggregometry；cTnI in blood was determined with che+luminescent technique；the expressions of TNF-α in blood and cardiac myocytes were measured with enzymelinked immunoadsorbent assay（ELISA）kits；myocardial tissues were determined with dry and wet weight；myocardial pathological damage was observed under the light at certain time（0h，6，12h）.Results Compared with NC group，platelet aggregation was increased apparently in ET group（P＜0.05）and gradually［（27.78±1.01），（32.41±3.04），（50.99±14.35）］ohm；platelet aggregation in CL+ET was lower（P＜0.05）.Compared with ET group，CL+ET group markedly inhibited the increasement of cTnI，TNF-αin blood and cardiac myocytes（P＜0.05）；the dry and wet weight of myocardial tissues had difference（P＜0.05）.The myocardial damage could be observed in 6h ET subgroup by light microscopy：the inflammatory cells were infiltrated，the fibrilla of myocardial cell were swelled，their cristae were disrupted，and the most severe myocardial damage could be observed with time going by.Conclusions Clopidogrel may inhibit platelet aggregation by blocking platelet P2Y12 receptor and then alleviate the LPS myocarditis.

sepsis；myocardial injury；clopidogrel；platelet；P2Y12 receptor

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.006

：2014-02-20，

2014-03-10）

國家臨床重點專科建設項目（衛辦醫政函［2012］649號）；廣西壯族自治區衛生廳醫藥衛生科研課題（No Z2002050）

朱繼金，男，教授，碩士生導師，研究方向：高血壓與冠心病的發病機理和防治及危重癥診治，E-mail：zhujijin63＠vip.sina.com