CD40—CD40L在兒童持續性免疫性血小板減少癥發病機制中的作用研究

鄧彩艷+馬占敏+胡玉蓮

[摘要] 目的 通過檢測CD40-CD40L在持續性免疫性血小板減少癥（Persistent ITP）患兒外周血單個核細胞中的表達情況，以揭示其在兒童持續性ITP發病機制中的作用。 方法 應用流式細胞術檢測20例持續性ITP患兒治療前后及20例對照組兒童外周血單個核細胞中CD40-CD40L的表達情況，用ELISA法檢測血小板抗體（PAIgG）。 結果 與對照組比較，CD40和CD40L治療前后的表達均增高（P<0.01，P<0.05），CD40治療前高于治療后（P<0.05），CD40L在兩組的表達則差異無統計學意義（P>0.05）；CD40、CD40L的表達與PAIgG均呈正相關（r分別為0.713、0.746，P<0.05）。 結論 CD40-CD40L共刺激信號異常可能為兒童持續性ITP發病機制之一，阻斷此共刺激途徑可能獲得較好的治療效果。

[關鍵詞] CD40；CD40L；免疫性血小板減少癥；兒童；持續性；發病機制

[中圖分類號] R593.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）07-61-03

The Effect of CD40 and CD40L in pathogenesis of children with persistent immune thrombocytopenia

DENG Caiyan MA Zhanmin HU Yulian

Department of Pediatrics， Zhengzhou Maternal and Child Health Hospital， Zhengzhou 450012， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CD40 and CD40L in peripheral blood mononuclear cells of patients with childhood Persistent immune thrombocytopenia（Persistent ITP）， and to explore their possible roles in the pathogenesis of the disease. Methods The positivity rates of CD40 and CD40L in peripheral blood mononuclear cells were measured by flow cytometry in 20 Persistent ITP patients （prior treatment and post treatment） and 20 normal controls. Platelet-associated antibody（PAIgG） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） technique. Results Compared with controls， the expression of CD40 and CD40L were higher in both prior treatment group and post treatment group（P<0.01，P<0.05）， Compared with post treatment group， the expression of CD40 in prior treatment group were higher（P<0.05=. The expression of CD40 and CD40L had positive correlation with PAIgG （r=0.713， 0.746； P<0.05）. Conclusion CD40 and CD40L pathway may play important roles in the pathogenesis of Persistent ITP， and it is possible to be a good therapeutic target if we can obstruct this way.

[Key words] CD40； CD40L； ITP； Children； Persistent； Pathogenesis

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是兒童時期常見的自身免疫出血性疾病，且近年來持續性和慢性ITP發病呈增多趨勢，激素、免疫球蛋白等常規治療效果差，不良反應多，病情遷延不愈，給家庭造成極大的心理和經濟負擔。大量研究證實，血小板抗體是導致血小板減少的關鍵因素。CD40-CD40L相互作用提供的共刺激信號可活化T、B淋巴細胞進而引起免疫反應，在血小板抗體的產生過程中可能起著重要作用。本研究通過應用流式細胞術檢測持續性ITP患兒治療前后外周血單個核細胞中CD40-CD40L的表達情況，并研究其與PAIgG產生的關系，為進一步研究ITP的發病機制和應用新的免疫治療方法提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

治療組為2011年1月～2013年7月住院的20例持續性ITP患兒，診斷均符合兒童持續性ITP診斷標準[1]，男14例，女11例，年齡4個月～11歲，平均年齡5.7歲，分別于治療前后收集外周血標本2mL；對照組外周血標本20例，取自本院正常體檢兒童，年齡6個月～11歲，男14例，女11例，平均年齡5.8歲。所有患兒及對照組家屬均知情同意，兩組年齡、性別比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器endprint

鼠抗人CD40-FITC、CD40L-PE均購自eBioscience公司，流式細胞儀 FACScan，美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD40、CD40L的檢測 采用密度梯度離心法提取外周血單個核細胞，取100?L單個核細胞懸液分別加入含單克隆熒光標記抗體CD40-FITC、CD40L-PE各10μL的試驗管中，混勻后20～25℃避光孵育20～30min，PBS液洗滌后上機檢測，用CELL Quest軟件分析。

1.3.2 PAIgG的檢測 采用ELISA法，PAIgG含量測定試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司。

1.4 統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件進行分析，實驗數據以（）表示，樣本符合正態分布，組間比較用單因素方差分析，相關分析用Pearson線性相關分析方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD40、CD40L的表達情況

（1）與對照組比較，CD40在治療前和治療后的表達均增高（t=8.327，P<0.01；t=5.549，P<0.05），CD40L在治療前和治療后的表達均增高（t=5.098，P<0.05；t=4.264，P<0.05）；（2）CD40在治療前表達高于治療后（t=3.363，P<0.05），CD40L治療前后表達差異無統計學意義（t=0.758，P>0.05）。見表1。

表1 持續性ITP患兒外周血單個核細胞CD40、CD40L的表達情況（，%）

組別 例數 CD40 CD40L

治療前 20 9.84±2.69*# 6.38±2.36▲

治療后 20 8.27±1.87▲ 5.85±2.73▲

對照組 20 6.45±2.08 4.37±1.94

注：與對照組相比，*P<0.01，▲P<0.05；治療前與治療后比較，#P<0.05

2.2 與PAIgG的相關性分析

CD40、CD40L與PAIgG呈正相關（r分別為0.713、0.746，P<0.05）。

3 討論

2009年美國血液學協會正式將特發性血小板減少性紫癜更名為免疫性血小板減少癥，新標準根據病程分為三型：新診斷的ITP（Newly ITP）：即自診斷之日起，病程在3個月之內；持續性ITP（Persistent ITP）：病程3～12個月，包括未獲得自發緩解或停止治療后不能維持完全緩解的患者；慢性ITP（ Chronic ITP）：病程持續12個月以上。80%～90%的兒童ITP患者常于6個月內獲得緩解[2]。ITP的發病機制復雜，目前認為與體液及細胞免疫紊亂、病毒及幽門螺桿菌感染、巨核細胞異常等多種因素有關。CD40-CD40L為體內特異性免疫系統重要的一對共刺激分子，在機體的體液免疫和細胞免疫反應中起重要作用，在自身抗體的形成中起重要作用，參與多種自身免疫性疾病的發病過程。在血小板抗體產生過程中，CD40/CD40L相互作用提供的共刺激信號在活化淋巴細胞進而引起免疫反應的過程中是必不可少的。研究證明ITP患兒體內存在T、B淋巴細胞的異常活化。

ITP的一線治療目前仍是以腎上腺糖皮質激素和IVIG為主，但治療效果并不理想，復發率高，且不能影響ITP的自然病程[3]。而達那唑、環孢素A、長春新堿等藥物副作用大，療效也并不理想。對于難治性ITP，脾切除術治愈率高，但存在嚴重出血風險，并需長期服用激素和其他免疫抑制劑，嚴重影響患兒的生活質量[4]。近年來對ITP發病機制的深入研究令許多定向免疫干預措施進入臨床，如應用抗RhD免疫球蛋白減少單核-巨噬細胞對血小板的吞噬；應用抗CD20單抗抑制B淋巴細胞功能，減少自身抗體的產生；應用血小板生成素（TPO）類似物促進巨核細胞增殖及發育成熟，以及IFN2α、霉酚酸酯（MMF）、造血干細胞移植等方法，均取得了一定療效[5-7]，但在兒童中的應用報道較少。

本實驗結果表明CD40、CD40L在持續性ITP患兒治療前后外周血單個核細胞的表達明顯增高，且CD40、CD40L的表達與PAIgG呈正相關，提示CD40-CD40L在PAIgG的產生中起重要作用，其表達增高促進了自身反應性B淋巴細胞激活，從而產生大量抗血小板抗體，使血小板破壞增多并生成減少。治療后CD40明顯降低，而CD40L治療前后比較差異無統計學意義，推測CD40L持續增高可能是少數持續性ITP患兒常規治療效果欠佳的原因之一，阻斷此通路可望減少自身抗體的產生，重建免疫穩態，為持續性ITP尤其是難治性ITP患兒的治療提供一個新思路。

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（上接第頁）

[參考文獻]

[1] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report from an international working group[J].Blood，2009，113：2386-2393.

[2] 盛光耀，翟慢慢.免疫性血小板減少癥研究新進展[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2013，18（3）：97-99.

[3] Tarantino M.Recent advances in the treatment of childhood immune thrombocytopenic purpura[J].Sem in Hematol，2006，43（3 supp l5）：11-17.

[4] Kang CM，Lee JG，Kim KS，et al.Long-term follow-up of laparoscopic splenectomy in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].J Korean Med Sci，2007，22 （3）： 420-424.

[5] Zaja F，BaccaraniM，Mazza P，et al.A prospective randomized study comparing rituximab and dexamethasone vs dexamethasone alone in ITP： results of final analysis and long term follow up[J].Blood （ASH AnnualMeeting Abstracts） ， 2008， 112 （11）：1.

[6] Bussel JB，Kuter DJ，George JN，et al.AMG531，a thrombopoiesis- stimulating protein for chronic ITP[J].New Engl J Med，2006，355（16）：1672-1681.

[7] 王弘，吳瓊，徐剛，等.霉酚酸酯治療難治性特發性血小板減少性紫癜10例[J].實用兒科臨床雜志，2010，25（3）：214-216.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

鼠抗人CD40-FITC、CD40L-PE均購自eBioscience公司，流式細胞儀 FACScan，美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD40、CD40L的檢測 采用密度梯度離心法提取外周血單個核細胞，取100?L單個核細胞懸液分別加入含單克隆熒光標記抗體CD40-FITC、CD40L-PE各10μL的試驗管中，混勻后20～25℃避光孵育20～30min，PBS液洗滌后上機檢測，用CELL Quest軟件分析。

1.3.2 PAIgG的檢測 采用ELISA法，PAIgG含量測定試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司。

1.4 統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件進行分析，實驗數據以（）表示，樣本符合正態分布，組間比較用單因素方差分析，相關分析用Pearson線性相關分析方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD40、CD40L的表達情況

（1）與對照組比較，CD40在治療前和治療后的表達均增高（t=8.327，P<0.01；t=5.549，P<0.05），CD40L在治療前和治療后的表達均增高（t=5.098，P<0.05；t=4.264，P<0.05）；（2）CD40在治療前表達高于治療后（t=3.363，P<0.05），CD40L治療前后表達差異無統計學意義（t=0.758，P>0.05）。見表1。

表1 持續性ITP患兒外周血單個核細胞CD40、CD40L的表達情況（，%）

組別 例數 CD40 CD40L

治療前 20 9.84±2.69*# 6.38±2.36▲

治療后 20 8.27±1.87▲ 5.85±2.73▲

對照組 20 6.45±2.08 4.37±1.94

注：與對照組相比，*P<0.01，▲P<0.05；治療前與治療后比較，#P<0.05

2.2 與PAIgG的相關性分析

CD40、CD40L與PAIgG呈正相關（r分別為0.713、0.746，P<0.05）。

3 討論

2009年美國血液學協會正式將特發性血小板減少性紫癜更名為免疫性血小板減少癥，新標準根據病程分為三型：新診斷的ITP（Newly ITP）：即自診斷之日起，病程在3個月之內；持續性ITP（Persistent ITP）：病程3～12個月，包括未獲得自發緩解或停止治療后不能維持完全緩解的患者；慢性ITP（ Chronic ITP）：病程持續12個月以上。80%～90%的兒童ITP患者常于6個月內獲得緩解[2]。ITP的發病機制復雜，目前認為與體液及細胞免疫紊亂、病毒及幽門螺桿菌感染、巨核細胞異常等多種因素有關。CD40-CD40L為體內特異性免疫系統重要的一對共刺激分子，在機體的體液免疫和細胞免疫反應中起重要作用，在自身抗體的形成中起重要作用，參與多種自身免疫性疾病的發病過程。在血小板抗體產生過程中，CD40/CD40L相互作用提供的共刺激信號在活化淋巴細胞進而引起免疫反應的過程中是必不可少的。研究證明ITP患兒體內存在T、B淋巴細胞的異常活化。

ITP的一線治療目前仍是以腎上腺糖皮質激素和IVIG為主，但治療效果并不理想，復發率高，且不能影響ITP的自然病程[3]。而達那唑、環孢素A、長春新堿等藥物副作用大，療效也并不理想。對于難治性ITP，脾切除術治愈率高，但存在嚴重出血風險，并需長期服用激素和其他免疫抑制劑，嚴重影響患兒的生活質量[4]。近年來對ITP發病機制的深入研究令許多定向免疫干預措施進入臨床，如應用抗RhD免疫球蛋白減少單核-巨噬細胞對血小板的吞噬；應用抗CD20單抗抑制B淋巴細胞功能，減少自身抗體的產生；應用血小板生成素（TPO）類似物促進巨核細胞增殖及發育成熟，以及IFN2α、霉酚酸酯（MMF）、造血干細胞移植等方法，均取得了一定療效[5-7]，但在兒童中的應用報道較少。

本實驗結果表明CD40、CD40L在持續性ITP患兒治療前后外周血單個核細胞的表達明顯增高，且CD40、CD40L的表達與PAIgG呈正相關，提示CD40-CD40L在PAIgG的產生中起重要作用，其表達增高促進了自身反應性B淋巴細胞激活，從而產生大量抗血小板抗體，使血小板破壞增多并生成減少。治療后CD40明顯降低，而CD40L治療前后比較差異無統計學意義，推測CD40L持續增高可能是少數持續性ITP患兒常規治療效果欠佳的原因之一，阻斷此通路可望減少自身抗體的產生，重建免疫穩態，為持續性ITP尤其是難治性ITP患兒的治療提供一個新思路。

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[參考文獻]

[1] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report from an international working group[J].Blood，2009，113：2386-2393.

[2] 盛光耀，翟慢慢.免疫性血小板減少癥研究新進展[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2013，18（3）：97-99.

[3] Tarantino M.Recent advances in the treatment of childhood immune thrombocytopenic purpura[J].Sem in Hematol，2006，43（3 supp l5）：11-17.

[4] Kang CM，Lee JG，Kim KS，et al.Long-term follow-up of laparoscopic splenectomy in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].J Korean Med Sci，2007，22 （3）： 420-424.

[5] Zaja F，BaccaraniM，Mazza P，et al.A prospective randomized study comparing rituximab and dexamethasone vs dexamethasone alone in ITP： results of final analysis and long term follow up[J].Blood （ASH AnnualMeeting Abstracts） ， 2008， 112 （11）：1.

[6] Bussel JB，Kuter DJ，George JN，et al.AMG531，a thrombopoiesis- stimulating protein for chronic ITP[J].New Engl J Med，2006，355（16）：1672-1681.

[7] 王弘，吳瓊，徐剛，等.霉酚酸酯治療難治性特發性血小板減少性紫癜10例[J].實用兒科臨床雜志，2010，25（3）：214-216.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

鼠抗人CD40-FITC、CD40L-PE均購自eBioscience公司，流式細胞儀 FACScan，美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD40、CD40L的檢測 采用密度梯度離心法提取外周血單個核細胞，取100?L單個核細胞懸液分別加入含單克隆熒光標記抗體CD40-FITC、CD40L-PE各10μL的試驗管中，混勻后20～25℃避光孵育20～30min，PBS液洗滌后上機檢測，用CELL Quest軟件分析。

1.3.2 PAIgG的檢測 采用ELISA法，PAIgG含量測定試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司。

1.4 統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件進行分析，實驗數據以（）表示，樣本符合正態分布，組間比較用單因素方差分析，相關分析用Pearson線性相關分析方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD40、CD40L的表達情況

（1）與對照組比較，CD40在治療前和治療后的表達均增高（t=8.327，P<0.01；t=5.549，P<0.05），CD40L在治療前和治療后的表達均增高（t=5.098，P<0.05；t=4.264，P<0.05）；（2）CD40在治療前表達高于治療后（t=3.363，P<0.05），CD40L治療前后表達差異無統計學意義（t=0.758，P>0.05）。見表1。

表1 持續性ITP患兒外周血單個核細胞CD40、CD40L的表達情況（，%）

組別 例數 CD40 CD40L

治療前 20 9.84±2.69*# 6.38±2.36▲

治療后 20 8.27±1.87▲ 5.85±2.73▲

對照組 20 6.45±2.08 4.37±1.94

注：與對照組相比，*P<0.01，▲P<0.05；治療前與治療后比較，#P<0.05

2.2 與PAIgG的相關性分析

CD40、CD40L與PAIgG呈正相關（r分別為0.713、0.746，P<0.05）。

3 討論

2009年美國血液學協會正式將特發性血小板減少性紫癜更名為免疫性血小板減少癥，新標準根據病程分為三型：新診斷的ITP（Newly ITP）：即自診斷之日起，病程在3個月之內；持續性ITP（Persistent ITP）：病程3～12個月，包括未獲得自發緩解或停止治療后不能維持完全緩解的患者；慢性ITP（ Chronic ITP）：病程持續12個月以上。80%～90%的兒童ITP患者常于6個月內獲得緩解[2]。ITP的發病機制復雜，目前認為與體液及細胞免疫紊亂、病毒及幽門螺桿菌感染、巨核細胞異常等多種因素有關。CD40-CD40L為體內特異性免疫系統重要的一對共刺激分子，在機體的體液免疫和細胞免疫反應中起重要作用，在自身抗體的形成中起重要作用，參與多種自身免疫性疾病的發病過程。在血小板抗體產生過程中，CD40/CD40L相互作用提供的共刺激信號在活化淋巴細胞進而引起免疫反應的過程中是必不可少的。研究證明ITP患兒體內存在T、B淋巴細胞的異常活化。

ITP的一線治療目前仍是以腎上腺糖皮質激素和IVIG為主，但治療效果并不理想，復發率高，且不能影響ITP的自然病程[3]。而達那唑、環孢素A、長春新堿等藥物副作用大，療效也并不理想。對于難治性ITP，脾切除術治愈率高，但存在嚴重出血風險，并需長期服用激素和其他免疫抑制劑，嚴重影響患兒的生活質量[4]。近年來對ITP發病機制的深入研究令許多定向免疫干預措施進入臨床，如應用抗RhD免疫球蛋白減少單核-巨噬細胞對血小板的吞噬；應用抗CD20單抗抑制B淋巴細胞功能，減少自身抗體的產生；應用血小板生成素（TPO）類似物促進巨核細胞增殖及發育成熟，以及IFN2α、霉酚酸酯（MMF）、造血干細胞移植等方法，均取得了一定療效[5-7]，但在兒童中的應用報道較少。

本實驗結果表明CD40、CD40L在持續性ITP患兒治療前后外周血單個核細胞的表達明顯增高，且CD40、CD40L的表達與PAIgG呈正相關，提示CD40-CD40L在PAIgG的產生中起重要作用，其表達增高促進了自身反應性B淋巴細胞激活，從而產生大量抗血小板抗體，使血小板破壞增多并生成減少。治療后CD40明顯降低，而CD40L治療前后比較差異無統計學意義，推測CD40L持續增高可能是少數持續性ITP患兒常規治療效果欠佳的原因之一，阻斷此通路可望減少自身抗體的產生，重建免疫穩態，為持續性ITP尤其是難治性ITP患兒的治療提供一個新思路。

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[參考文獻]

[1] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report from an international working group[J].Blood，2009，113：2386-2393.

[2] 盛光耀，翟慢慢.免疫性血小板減少癥研究新進展[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2013，18（3）：97-99.

[3] Tarantino M.Recent advances in the treatment of childhood immune thrombocytopenic purpura[J].Sem in Hematol，2006，43（3 supp l5）：11-17.

[4] Kang CM，Lee JG，Kim KS，et al.Long-term follow-up of laparoscopic splenectomy in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].J Korean Med Sci，2007，22 （3）： 420-424.

[5] Zaja F，BaccaraniM，Mazza P，et al.A prospective randomized study comparing rituximab and dexamethasone vs dexamethasone alone in ITP： results of final analysis and long term follow up[J].Blood （ASH AnnualMeeting Abstracts） ， 2008， 112 （11）：1.

[6] Bussel JB，Kuter DJ，George JN，et al.AMG531，a thrombopoiesis- stimulating protein for chronic ITP[J].New Engl J Med，2006，355（16）：1672-1681.

[7] 王弘，吳瓊，徐剛，等.霉酚酸酯治療難治性特發性血小板減少性紫癜10例[J].實用兒科臨床雜志，2010，25（3）：214-216.

（收稿日期：2013-12-11）endprint