PD98059和LY294002對非酶糖基化終產物誘導人RPE細胞表達VEGF的影響△

楊曉春 許建彪 唐羅生

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)中起著重要的作用，它是DR血管生成和滲漏必不可少的誘導因子，涉及病變的各個階段[1]。近年研究表明，DR患者體內的一種毒性物質非酶糖基化終產物(advanced glycation end-products，AGE)能促使視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞表達VEGF增加[2]。P44/42 MAPK和PI3K/Akt是兩個重要的細胞內信號轉導通路，對VEGF的表達具有重要作用[3-4]，但它們是否參與了AGE誘導的RPE細胞外VEGF的表達，目前尚未見相關報道。本文通過研究p44/42 MAPK阻斷劑PD98059和PI3K/Akt阻斷劑LY294002對AGE誘導的ARPE-19細胞外VEGF表達的影響，探討AGE誘導VEGF表達的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料人RPE細胞株ARPE-19由湖南大學生物實驗室惠贈，SP法鑒定，取3-5代細胞用于本實驗。無糖DMEM培養液購自Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程技術有限公司；PD98059和LY294002購自Sigma公司(美國)；VEGF試劑盒、鏈霉親和素-生物素化-過氧化物酶購自武漢博士德生物技術有限公司；兔抗人磷酸化Akt單克隆抗體、鼠抗人磷酸化p44/42單克隆抗體為碧云天生物技術研究所進口分裝；羊抗鼠抗兔二抗檢測試劑盒購自中杉金橋生物技術有限公司。AGE及AGE對照物的制備同文獻[5]。預實驗確定試劑濃度及干預時間。

1.2方法實驗分為對照組、AGE組(包括時間依賴組、劑量依賴組)、PD98059組、LY294002組和PD98059+LY294002組。人RPE細胞株ARPE-19細胞按100×103個接種于24孔板中，放入經體積分數4%多聚賴氨酸處理的蓋玻片，以含體積分數15%FBS的無糖DMEM液培養至80%融合，換不含FBS的無糖DMEM液培養24 h。根據分組分別加入含下述試劑的培養液。

1.2.1AGE處理ARPE-19細胞時間依賴組加入100 mg·L-1AGE，每組在含體積分數5%CO2、37 ℃培養箱中分別培養2 h、6 h、8 h、12 h、24 h。……