蛋白酶激活受體_1在高壓氧預處理誘導大鼠腦出血后腦保護中的作用

胡海濤　邱霞　熊冰

[摘 要] 目的 探討蛋白酶激活受體_1（PAR_1）在高壓氧預處理（HBOP）誘導的大鼠腦出血后神經保護中的作用。方法 （1）SD大鼠接受連續5次HBOP或假預處理（SP），預處理結束24h后，建立基底節區腦出血模型，72h后處死，觀察腦水含量，神經功能評分，TUNEL法檢測血腫周圍神經細胞凋亡，免疫組化方法檢測血腫周圍組織PAR_1的表達。（2）SD大鼠HBOP預處理前基底節區給予PAR_1激動劑（PAR_AP）或生理鹽水，接受連續5次HBOP，預處理結束24h后，建立基底節區腦出血模型，72h后處死，觀察腦水含量、神經功能評分，血腫周圍神經細胞凋亡和PAR_1的表達。結果 高壓氧預處理減輕大鼠腦出血后72h血腫周圍腦組織水腫[（814±08）% vs （802±06）%，P<001]，改善神經功能評分，減少血腫周圍神經細胞凋亡，HBOP降低了血腫周圍組織PAR_1的表達（P<005）。HBOP前給予PAR_AP激活PAR_1受體，消除了HBOP誘導的神經保護作用。結論 高壓氧預處理通過減輕腦組織水腫，減少神經細胞凋亡起到神經保護作用，下調PAR_1的表達是可能的作用機制之一。

[關鍵詞] 高壓氧；預處理；腦出血；腦水腫；蛋白酶激活受體

中圖分類號：R7433 文獻標識碼：A 文章編號：1009_816X（2014）02_0098_04

doi：103969/jissn1009_816x20140204Effects of Protease_activated Receptor_1（PAR_1） on Brain Tolerance after Experimental Intracerebral Hemorrhage Induced by Hyperbaric Oxygen Preconditioning HU Hai_tao， QIU Xia， XIONG Bing Department of Neurology， The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Medical College， Zhejiang 310009， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of protease_activated receptor_1（PAR_1） on brain tolerance after experimental intracerebral hemorrhage induced by hyperbaric oxygen preconditioning Methods This study had two experimental groups Group 1， Sprague_Dawley rats received five consecutive sessions of hyperbaric oxygen preconditioning （HBOP） or sham preconditioning （SP） Twenty_four hours after preconditioning， rats received an infusion of autologous blood into the caudate They were killed 72 hours later ，and brain water content， neurological function， neuronal cell apoptosis and PAR_1 expression were measured Group 2， rats received an intracaudate injection of PAR_1 agonist peptide （PAR_AP） or normal saline before HBOP， then they received five consecutive sessions of HOBP Twenty_four hours after HOBP， rats received an intracaudate blood infusion Brain water content， neurological function， neuronal cell apoptosis and PAR_1 expression were measured 72 hours after the rats were killed Results HOBP reduced perihematomal edema 72 hours after ICH （（814±08）% vs （802±06）%，P<001）， reduced neurological deficits and decreased perihematoma neuronal cell apoptosis and improved PAR_1 expression（P<005） Intracaudate infusion of PAR_AP activated PAR_1 expression and abolished HBOP induced neuro_protection Conclusions HOBP attenuates brain edema formation， neuronal cell apoptosis and neurological deficits after ICH Inhibition of PAR_1 contributes to that effects

[Key words] Hyperbaric oxygen； Preconditioning； Intracerebral hemorrhage； Brain edema； Protease_activated protein_1

高壓氧預處理（HBOP）誘導的“腦缺血耐受”現象在很多動物實驗中被證實[1，2]。Qin[3]等研究發現，連續5天HBOP能顯著減輕SD大鼠腦出血24h后腦水腫，誘導腦出血后“腦損傷耐受”，但作用機制尚不明確。腦出血后血腫釋放的凝血酶是誘導腦組織損傷過程的關鍵因子之一，與神經細胞凋亡、腦組織水腫密切相關。高濃度的凝血酶主要通過結合蛋白酶激活受體_1（PAR_1），激活RhoA、蛋白激酶C（PKC）和絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）等通路產生神經毒性作用[4]，凝血酶抑制劑能降低其毒性作用。以往的體外研究也發現，凝血酶預處理誘導的神經元保護作用是通過PAR_1介導的，PAR_1激動劑可以模擬凝血酶預處理的作用[5]。本文通過觀察HBOP以及PAR_1激動劑（PAR_AP）對實驗性大鼠腦出血后腦水腫，神經功能評分以及血腫周圍神經細胞凋亡的影響，探討PAR_1在HBOP誘導腦出血后腦保護中的作用。

1 資料與方法

11 動物及分組：選用雄性Spradgue_Dawley大鼠48只，體重300～350g，由浙江省醫學科學院動物實驗中心提供。本實驗分為2個部分：（1）將大鼠隨機分為高壓氧預處理（HBOP）組（n=12）和假預處理（SP）組（n=12）。最后一次預處理結束24h后，立體定向基底節內注射大鼠自體股動脈血100μL建立基底節腦出血模型。模型建立72h后，進行大鼠神經功能評分，將其中12只大鼠（HBOP組和SP組各6只）斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量；另外12只大鼠（HBOP組和SP組各6只）處死，取腦組織切片；（2）將24只大鼠分為PAR_1激動劑（PAR_AP）組（n=12）和溶劑對照（Vehicle）組（n=12），其中PAR_AP組在預處理前1h，右側尾狀核內給予PAR_AP（5μl，10nmol，美國Anaspec公司），溶劑對照組給予生理鹽水5μl。預處理結束后24h，制備大鼠腦出血模型，模型建立72h后，評價大鼠神經功能，測定腦組織水含量、神經細胞凋亡和PAR_1的表達。

12 方法：

121 高壓氧預處理：HBOP組大鼠置入動物實驗用高壓氧艙內，以醫用純氧作氣源，15min內勻速加壓至3個絕對大氣壓（1個絕對大氣壓≈100kPa）。通過調整進出口氣流量維持氧艙內壓力平穩，并維持艙內氧濃度99%以上，持續1小時后于30分內均勻降壓至1個絕對大氣壓，1次/天，連續5天。SP組大鼠也置入高壓氧艙內，只暴露于1個絕對大氣壓的空氣中，1次/天，連續5天。

122 大鼠基底節腦出血模型的建立：大鼠最后一次預處理結束24h后，腹腔內注射戊巴比妥麻醉（40mg/kg），右側股動脈插管，取血約03ml，立體定位儀（Kopf Instruments，Tujunga，CA）下右側尾狀核注射非肝素化自體血100μl（坐標：囟門前02mm，向右40mm，腹側進針55mm），微泵以1μl/min的速度注入，注畢停留2min后緩慢退針。術中無菌操作，保持體溫在375℃，并監測平均動脈壓、血氣分析、紅細胞壓積和血糖等，術后自由進食、進水。

123 神經功能評分：在大鼠術前和術后72h，采用Hua[6]等的大鼠轉角試驗和前肢放置試驗來判斷神經功能缺損的程度。轉角試驗：將大鼠放在角度為30°的夾角內，觀察其轉身出角的轉向，向左或向右，連續10次，每次間隔時間不小于15秒，神經功能得分=（右轉次數/總次數）×100%。大鼠前肢放置試驗：大鼠前爪懸空，每次試驗用一側胡須輕觸桌面，正常反應為大鼠前肢即刻抓向桌面，記1分，共10次，記錄前肢正確放置次數的百分比。

124 腦組織水含量：大鼠腦出血模型制作72h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉深麻醉（60mg/kg），快速斷頭完整取出腦組織，以皮層穿刺點為中心作一冠狀位斷層（層厚約3mm），該斷層腦組織再沿中線分離為右側皮層、右側基底節、左側皮層、左側基底節，另取小腦作為參照。然后將標本在100℃下烘干24h再進行稱量干質量。腦組織水含量（%）=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

125 TUNEL染色和免疫組化染色：大鼠在相應時間點予戊巴比妥過量麻醉（60mg/kg），含4%多聚甲醛的01mol/L PBS液（pH 74）心內灌注，至大鼠四肢變硬、發白，斷頭完整取出腦組織，4℃下在上述固定液中繼續固定4～6h后，轉移至30%蔗糖中脫水3～4d，待腦組織沉到底部，用OCT包埋劑包埋后進行冰凍切片，厚度為18μm。取切片行TUNEL法免疫組化染色，鏡下觀察血腫周圍神經細胞凋亡情況（方法按TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書進行）。PAR_1的染色步驟：切片室溫干燥5min，放入03%Tritonl00的01mol/L PBS液浸泡15min，用10%的正常山羊血清孵育30min。加入兔抗鼠單克隆PAR_1（濃度1：500，Cell signaling公司），4℃過夜。添加辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育90min。以上每完成一步驟后均用PBS液漂洗3次×5min/次。DAB顯色2～5min，封片，400倍光學顯微鏡下觀察。隨機選取切片上5個不同的血腫周圍組織，計算陽性細胞數，取平均值。

13 統計學處理：采用SPSS160版統計軟件包，結果用（x -±s）表示，采用成組設計資料的t檢驗和單因素方差分析，P<005為差異有統計學意義。

2 結果

21 實驗大鼠的生理參數比較：本研究各組大鼠的平均動脈壓、血氣分析、紅細胞壓積、血糖等各項生理指標變量，均在正常范圍，各組間差異無統計學意義（P>005）。

22 HBOP對大鼠腦出血72小時后神經功能評分及腦水含量的影響：大鼠腦出血72小時后，HBOP組大鼠神經功能評分與SP組相比顯著改善，差異有統計學意義（P<001），見表2。HBOP組大鼠血腫側基底節水含量顯著低于對照組（P<001），其他部位腦組織水含量組間差異無統計學意義，見表3。

23 HBOP減少大鼠腦出血72小時后血腫周圍腦組織細胞凋亡和PAR_1的表達：TUNEL法染色中典型細胞凋亡形態特征為胞體縮小，胞核濃染成棕色或棕黑色。本實驗顯示，大鼠腦出血后72小時，HBOP組大鼠血腫周圍腦組織TUNEL陽性細胞數少于SP組[（1057±312）/mm2 vs （1886±244）/mm2，P<001]。免疫組化分析顯示腦出血周圍腦組織PAR_1表達陽性的細胞數，HBOP組顯著少于SP組[（1583±267）/mm2 vs （2944±346）/mm2，P<001]。

24 PAR_AP對HBOP后出血周圍腦組織PAR_1的表達，神經細胞凋亡、腦水含量以及神經功能的影響：HBOP前腦內給予PAR_AP顯著增加了HBOP大鼠腦出血72小時后血腫周圍腦組織PAR_1表達陽性細胞數[（2367±422）/mm2 vs （1713±337）/mm2，P<001]以及血腫周圍凋亡的神經細胞[（1638±283）/mm2 vs （1175±291）/mm2，P<001]。PAR_AP增加了HBOP大鼠腦出血72小時后出血側基底節區腦水含量[（810±03） vs （805±04），P<005]。PAR_AP使HBOP大鼠腦出血72h后神經功能也明顯惡化，見表4。

3 討論

1996年Wada[1]首次發現重復HBOP能顯著減輕沙土鼠海馬區神經組織缺血后細胞損傷，這種現象稱為“腦缺血耐受”，此后多位學者發現HBOP在肝臟、脊髓、心臟等器官均能誘導該現象[7，8]。Qin[3]等研究發現，HBOP能減輕大鼠腦出血后24h腦水腫，減少血腫周圍神經細胞凋亡起到神經保護作用。既往實驗研究表明大鼠腦出血后腦內水腫高峰期在出血后3～4天，腦組織損傷也最嚴重[9]。我們的研究結果發現HBOP顯著減輕大鼠腦出血72h時的腦水腫，血腫周圍的神經細胞凋亡與假預處理組比較也有下降，同時神經功能顯著改善，提示HBOP減輕腦出血后腦水腫和神經細胞凋亡有一定的持續性。

腦出血后血液在凝固過程中產生的大量凝血酶具有細胞毒性作用，是出血后一系列病理生理變化而致繼發性腦損傷的關鍵物質[10]，凝血酶特異性抑制劑-水蛭素可以抑制PAR_1的表達，減輕神經細胞損傷。凝血酶受體是一種蛋白酶激活受體（PAR），PAR_1在腦內分布最廣泛，腦出血后PAR_1在凝血酶介導的神經細胞損傷中起主要作用。腦出血后，凝血酶的產生是一個持續性的過程，姜亞軍[11]等發現PAR_1的表達高峰與細胞凋亡和腦水腫的高峰一致，均在腦出血72h左右，提示PAR_1參與了腦出血后腦損傷的全過程。以往我們的體外研究也發現，凝血酶預處理誘導的神經元保護作用是通過PAR_1介導的，PAR_1激動劑可以模擬凝血酶預處理的作用[5]。PAR_1活化后激活細胞內多個信號傳導通路，如激活RhoA、蛋白激酶C、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK），激活核內蛋白合成酶的表達，促進細胞凋亡蛋白的表達和釋放，加重腦水腫和繼發性腦損傷[4，12]。Gingrich[13]等的研究發現PAR_1介導的神經細胞損傷機制也可能涉及NMDA受體作用。本實驗的研究結果發現，HBOP可以降低腦出血后血腫周圍神經細胞PAR_1的表達，預處理前尾狀核內給予PAR_1激動劑，增加了血腫周圍神經細胞PAR_1的表達，抑制了HBOP誘導的減輕腦出血后腦水腫、減少神經細胞凋亡和改善神經功能損害的神經保護作用。這些結果提示了PAR_1水平的下調在HBOP誘導的腦保護作用中起到重要作用，是可能的機制之一。

綜上所述，HBOP可能通過下調PAR_1的表達，降低細胞凋亡相關信號通路的激活，減少血腫周圍的神經細胞凋亡，從而起到減輕腦出血后腦水腫和改善神經功能的作用。

參考文獻

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