地爾硫卓對心臟缺血再灌注后心肌炎癥的影響研究

王智明

·實驗研究·

地爾硫卓對心臟缺血再灌注后心肌炎癥的影響研究

王智明

目的探討地爾硫卓對心臟缺血再灌注后心肌炎癥的影響。方法首先建立大鼠心臟缺血再灌注模型, 將存活大鼠隨機分為缺血再灌注組(I/R組)和地爾硫卓組(D組), 另設假手術組(S組)作為對照。分別在術后1周、2周、4周三個時間點, 對各組大鼠進行超聲心動圖檢測、心肌炎癥細胞檢測以及多種細胞炎癥因子檢測。結果術后第4周超聲心動圖檢測, I/R組與S組和D組比較, 左心室射血分數(EF)和左心室短軸縮短率(FS)均有明顯下降, 但左心室重量(LVM)卻明顯增加, P＜0.05, 差異有統計學意義, 心臟功能受到嚴重影響；I/R組炎癥細胞浸潤情況明顯嚴重于S組和D組；I/R組致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α在缺血再灌注之后有明顯高表達, 抗炎因子IL-10和TGF-β1表達水平較低。結論心臟出現缺血再灌注之后, 地爾硫卓可以有效抑制炎癥細胞的活化和炎癥因子的分泌, 能夠有效減輕心肌細胞炎癥反應, 較好的改善心臟功能, 為地爾硫卓臨床治療心臟缺血再灌注后心肌炎癥提供了理論基礎。

地爾硫卓；心臟缺血再灌注；心肌炎癥

心臟缺血再灌注是冠狀動脈再通后的主要并發癥, 極易引發患者心肌損傷, 甚至造成死亡。研究表明, 心臟缺血再灌注導致的心肌炎癥與心肌細胞內鈣離子濃度有密切關系,而地爾硫卓(Diltiazem)作為鈣離子通道阻滯劑, 能夠起到保護心肌細胞、避免心肌炎癥的作用, 主要機制可能與其抑制心肌細胞內鈣離子濃度有關［1］。本文通過研究大鼠心臟缺血再灌注模型中淋巴細胞表達的各種炎癥因子含量以及使用地爾硫卓干預之后各種炎癥因子含量發生的變化以及心肌炎癥反應的變化, 來探討地爾硫卓對心臟缺血再灌注后心肌炎癥的影響, 現報告如下。

1 材料與方法

1.1大鼠心臟缺血再灌注模型的建立與實驗分組 選擇實驗大鼠：雄性, 體重200～250 g, 均符合Sprague-Dawley清潔級。模型建立前記錄大鼠的體重, 然后用戊巴比妥鈉進行注射麻醉, 使用小動物呼吸機通過氣管插管輔助呼吸, 操作過程中時刻監視心電圖的變化。在左側胸腔處實行開胸, 并打開心包, 在左心右下緣1 mm附近, 使用無損傷縫針穿過左冠狀動脈的心肌表層, 進行結扎, 30 min后恢復血流, 最后逐層縫合胸腔。大鼠恢復自主呼吸后去掉呼吸機, 保溫待其清醒。假手術組同樣經歷以上手術過程, 但不進行結扎。選擇術后存活大鼠進行后續實驗, 所有大鼠均在相同條件下飼養。

大鼠分組：①D組：術后用地爾硫卓干預組30只, 選擇1周、2周、4周三個時間點分別注射和口服地爾硫卓,每個時間點10只；②I/R組：心臟缺血再灌注組30只, 在相同時間點注射和口服生理鹽水作為對照；③S組：假手術組30只, 同樣時間注射和口服生理鹽水。

1.2地爾硫卓藥物用量 參照中國《不穩定心絞痛治療建議》中推薦的成人用量30～60 mg t.i.d./q.i.d., 同時參考國外試驗用量360 mg/d［2］。本實驗制定的D組大鼠用藥量為：每天36 mg/200 g, 進行冠狀動脈結扎手術后對大鼠進行尾靜脈注射地爾硫卓4.5 mg/4.5 ml, 輸液泵維持3 h, 后該改為灌胃36 mg/4 ml·200g(36 mg地爾硫卓+4 ml生理鹽水), 給藥1次/d直到實驗結束。

1.3超聲心動圖檢測 在每個時間點處, 1周、2周、4周三個時間點, 進行超聲心動圖檢測。先用適量戊巴比妥鈉對大鼠進行注射麻醉, 用二維圖像引導做出M型曲線, 并測量。每個時間點選取5個心動周期, 分別記錄各項指標值并計算平均值作為該指標的實驗數據進行記錄, 同時進行圖像錄像。

超聲檢測指標包括：心率(HR)；左心室舒張末期內徑(LVDd)和收縮末期內徑(LVDs)；左心室舒張末期前壁厚度(AWT)和后壁厚度(PWT)；左心室舒張末期容積(LVEDV)和收縮末期容積(LVESV), 計算公式：V=1.04×D3, 其中D為內徑；左心室重量(LVM)=［1.05×(LVDd+AWT+PWT)］3-LVDd3；左心室短軸縮短率(%FS)= (LVDd-LVDs)/LVDd×100%；每心搏量(SV)= LVEDV-LVESV；左心室射血分數(%EF)=SV/ LVEDV×100%。

1.4心肌炎癥細胞檢測 在每個時間點, 提取各組大鼠心肌組織制作石蠟切片, 并用HE染色, 統計各種炎癥細胞的數量并記錄。

1.5大鼠心肌細胞炎癥因子檢測 在每個時間點, 提取各組大鼠心肌細胞內各種細胞炎癥因子RNA, 然后逆轉錄并進行PCR反應, 檢測各種細胞因此的含量。細胞炎癥因子主要包括致炎因子：IL-1β(Interleukin 1β, 白介素-1β)、IL-6(白介素-6)、TNF-α(Tumor necrosis factorα, 腫瘤壞死因子-α),以及抗炎因子：IL-10(白介素-10)、TGF-β1(Transforming growth factor-β1, 轉化生長因子-β1)。

1.6統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析,計量資料以均數±標準差表示, 采用χ2檢驗, 當P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠超聲心動圖變化情況 術后1周和2周, 各組大鼠超聲心動圖檢測并沒有顯著性差異；術后第4周超聲心動圖檢測, I/R組與S組和D組比較, 左心室射血分數(EF)和左心室短軸縮短率(FS)均有明顯下降, P＜0.05, 差異有統計學意義；左心室重量(LVM)I/R組也明顯高于S組和D組, P＜0.05,差異有統計學意義, 證明I/R組心室增厚嚴重。詳見表1。

表1各組大鼠超聲心動圖變化情況

表1各組大鼠超聲心動圖變化情況

注：P值為I/R組分別與S組和D組相比較的差異系數

組別HR(bpm)LVM(g)LVEDV(ml)LVESE(ml)SV(ml)EF(%)FS(%) S 462±340.68±0.120.19±0.030.03±0.020.15±0.0388.3±2.956.7±3.7 I/R401±290.92±0.110.20±0.040.06±0.030.14±0.0259.6±3.126.7±2.1 D 359±310.81±0.120.18±0.050.05±0.020.13±0.0273.7±2.937.4±2.6 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.2各組大鼠術后第4周時心肌炎癥細胞變化情況 術后第4周時, 光鏡下觀察各組大鼠心肌組織切片并統計各種心肌炎癥細胞的數目。S組心肌炎癥細胞很少；I/R組炎癥明顯, 中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤明顯；D組經過地爾硫卓治療, 心肌炎癥細胞明顯減少；統計分析I/R組與S組和D組相比較炎癥細胞明顯較多, P＜0.05, 差異有統計學意義。詳見表2。

表2各組大鼠術后第4周時心肌炎癥細胞變化情況n=10)

表2各組大鼠術后第4周時心肌炎癥細胞變化情況n=10)

注：P值為I/R組分別與S組和D組相比較的差異系數

組別中性粒細胞巨噬細胞淋巴細胞S 10±68±55±2 I/R108±14103±1146±5 D 51±1248±1321±4 P值P＜0.05P＜0.05P＜0.05

2.3各組大鼠術后心肌細胞炎癥因子表達情況 結果顯示致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α在缺血再灌注之后有明顯的提高, 術后1～2周達到峰值, 在第4周稍微降低, 但含量仍較高, 使用地爾硫卓進行治療之后, 致炎因子表達明顯降低, P＜0.05, 差異有統計學意義。I/R組與D組抗炎因子IL-10和TGF-β1表達水平相近, 都沒有高水平表達, 因此I/R組表現出的炎癥反應明顯強于D組。詳見表3。

表3各組大鼠術后心肌細胞炎癥因子變化情況n=10)

表3各組大鼠術后心肌細胞炎癥因子變化情況n=10)

組別第1周第2周第4周IL-1βS0.211±0.0060.124±0.0040.113±0.017 I/R1.658±0.0211.621±0.0251.562±0.034 D0.564±0.0080.634±0.0150.572±0.024 IL-6S0.213±0.0080.212±0.0070.211±0.005 I/R1.102±0.0130.924±0.0150.756±0.014 D0.534±0.0070.512±0.0040.498±0.006 TNF-αS0.224±0.0020.153±0.0070.132±0.004 I/R1.652±0.0141.317±0.0171.134±0.012 D0.762±0.0130.634±0.0110.542±0.012 IL-10S0.143±0.0070.086±0.0040.032±0.001 I/R0.624±0.0140.586±0.0160.241±0.027 D0.543±0.0120.521±0.0110.086±0.007 TGF-β1S0.204±0.0030.156±0.0140.127±0.004 I/R0.678±0.0160.627±0.0130.586±0.006 D0.624±0.0210.581±0.0240.241±0.007

3 討論

心臟缺血再灌注引起心肌損傷主要是指心臟在短時間內出現供血中斷后再恢復供血, 使心肌出現損傷, 且心肌損傷與胞內鈣離子濃度升高有密切關系。心臟缺血再灌注后鈣離子濃度升高可引起心肌炎癥等心肌損傷的主要機制有以下幾個方面：Ca2+濃度升高激活Ca2+依賴性蛋白酶、Ca2+依賴性核酸內切酶以及Ca2+依賴性磷脂酶, 從而對細胞產生毒害作用, 誘導心肌細胞細胞凋亡［3］；心臟缺血再灌注引起內皮細胞Ca2+濃度升高, 直接對內皮細胞造成損傷, 還可以增加內皮細胞中粘附因子的表達, 促進血小板和炎癥細胞與內皮細胞的粘附, 誘導心肌出現炎癥反應［4］。本實驗結果顯示, 大鼠心臟缺血再灌注后心肌細胞出現不同程度的死亡, 在第4周時心臟出現嚴重的功能性障礙, 應用地爾硫卓進行治療的D組大鼠心臟功能得到了有效改善。

光鏡下觀察各組大鼠在心臟缺血再灌注之后心肌細胞出現炎癥情況發現, 心肌細胞出現明顯的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤。文獻報道［5］, 冠狀動脈堵塞后, 心肌組織缺血區會有大量白細胞的聚集, 且再灌注后白細胞數目不但沒有減少反而有增多的趨勢。心肌組織缺血較輕的區域白細胞聚集數目也較少。研究表明, 心臟缺血再灌注時心肌組織內白細胞的聚集機制可能與胞內鈣離子濃度升高有關。

本實驗中觀察各組大鼠心肌細胞炎癥因子表達情況, 致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達在心臟缺血再灌注之后有明顯的提高, 而抗炎因子IL-10和TGF-β1在缺血再灌注之后一直低水平表達, 因此心肌細胞出現嚴重的炎癥反應。TNF-α能夠激活和聚集心肌細胞中白細胞, 增強白細胞的吞噬能力, 促進白細胞與內皮細胞的粘附作用, 從而引起心肌炎癥［6］；IL-1β可激活炎癥級聯反應, 活化中性粒細胞,上調粘附因子的表達, 促進TNF-α介導的炎癥反應；IL-6能夠誘導T細胞的增殖與分化, 促進中性粒細胞的分化［7］。IL-10和TGF-β1均具有免疫抑制作用, 通過調節免疫細胞因子, 抑制炎癥反應［8］。

綜上所述, 心臟出現缺血再灌注之后, 地爾硫卓可以有效抑制炎癥細胞的活化和炎癥因子的分泌, 減輕心肌細胞炎癥反應, 改善心臟功能, 為地爾硫卓臨床治療心臟缺血再灌注后心肌炎癥提供了理論基礎。

［1］ 劉英, 程翔, 廖玉華.鈣通道阻滯劑與心血管免疫炎癥的關系.中國藥理學通報, 2007, 23 (2):141-143.

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［4］ 劉英, 廖玉華, 程翔, 等.大鼠心肌梗塞后心肌炎癥反應和細胞因子表達.中國免疫學雜志, 2004, 20 (12):858-861.

［5］ 程翔, 廖玉華, 李彬, 等.心肌梗死后心功能不全患者輔助性T細胞功能失衡及意義.中華心血管病雜志, 2005, 33 (6):526-528.

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［8］ Ferenc B, Timea B, Attila M , et al.Effect of hyperglycemia on the basal cytosolic free calcium level, calcium signal and tyrosinephosphorylation in human T-cells.Immunology Letters, 2002, 82(1):159-164.

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