阿托伐他汀對腎間質纖維化大鼠腎臟Toll樣受體4表達的影響

樸明姬

阿托伐他汀對腎間質纖維化大鼠腎臟Toll樣受體4表達的影響

樸明姬

目的觀察阿托伐他汀對腎間質纖維化大鼠模型的腎組織Toll樣受體4(TLR4)表達的影響。方法40只10周齡 SD 大鼠隨機分為4 組:假手術組、單側輸尿管梗阻(UUO)組和治療組(分為小劑量阿托伐他汀組和大劑量阿托伐他汀組)。左側輸尿管結扎法制作腎間質纖維化大鼠動物模型。Masson染色觀察和評價腎組織炎癥、纖維化程度。免疫組化SP法檢測梗阻側腎組織TLR4表達部位和強度, ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量。結果假手術組左腎組織炎癥浸潤不明顯, UUO組有大量炎性細胞浸潤, 并出現明顯的間質纖維化；小劑量阿托伐他汀組和大劑量阿托伐他汀組較UUO組腎間質纖維化明顯減輕, 但兩組間無顯著性差異；與UUO組比較, 兩治療組的腎功、腎組織TLR4和TNF-α含量顯著下降 , 但小劑量和大劑量治療組間無顯著性差異。各組間血脂無顯著性差異。結論腎組織TLR4和TNF-α在腎間質纖維化發病過程中起著重要的作用, 阿托伐他汀可以通過非降脂相關的機制延緩腎間質纖維化。

腎間質纖維化；阿托伐他汀；Toll樣蛋白4；TNF-α

腎間質纖維化是各種炎癥和非炎癥性腎臟疾病進展的最終結局, 是所有慢性進行性腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同形態學特點, 是導致終末期腎衰竭的重要原因之二［1］。目前認為腎間質纖維化受多方面因素的影響, 近年免疫、炎癥學說倍受關注。Toll樣受體(Toll-1ike receptors, TLRs)被認為是目前哺乳動物唯一將細胞外抗原識別信息向細胞內傳遞并引發炎癥反應的關鍵跨膜蛋白［2］, 是參與免疫炎癥反應的一個關鍵因素, 現認為TLR是介導免疫和炎癥反應的主體。本實驗以單側輸尿管梗阻模型為研究對象, 研究阿托伐他汀在大鼠腎間質纖維化中對TLR4和TNF-α的影響, 以探討阿托伐他汀對腎間質纖維化的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 SD雌性大鼠40只, 體重200～220 g(大連醫科大學實驗動物中心提供)。實驗前于本院動物實驗中心飼養兩周, 飼養環境為清潔級。制模型前禁食水12 h。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與標本采集 雌性大鼠40只 隨機分為4組: 假手術組、UUO組、小劑量阿托伐他汀組(20 mg/(kg·d)、大劑量阿托伐他汀組(50 mg/(kg·d), 阿托伐他汀(立普妥,由輝瑞制藥有限公司提供)。10%水合氯醛0.4 ml·(100 g)-1腹腔注射麻醉, 打開腹腔沿左腎下極尋找到左輸尿管, 用4.0絲線上下結扎兩處, 然后從中剪斷輸尿管以防逆行性感染。假手術組大鼠打開腹腔后分離左側輸尿管但不結扎, 隨即關閉腹腔。各藥物治療組均于術前1 d開始用相應藥物等量灌胃, 共計給藥14 d。假手術組和UUO組以等量蒸餾水灌胃14 d。第14天各組大鼠腹主動脈取血制備血清, 測定血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)和血脂, 取左側腎組織, - 80℃冰箱保存,取左側腎組織用10%中性甲醛溶液固定, 常規方法制備切片行病理檢查。

1.2.2病理學觀察 左側腎組織行HE及Masson染色, 光鏡觀察腎間質纖維化情況。取Masson染色切片, 每張切片觀察腎皮質中8個不含腎小球高倍鏡視野(×400), 以MAP IS-500多媒體病理彩色分析系統計算每例切片腎間質綠染面積占整個視野百分比, 對腎間質纖維化定量分析。

1.2.3ELISA雙抗體夾心法測定左腎組織TNF-α 取左腎組織用PBS液沖洗、稀釋、制成勻漿, 離心取上清液測定TNF-α含量(試劑盒購自美國RD公司)。

1.2.4免疫組化SP法檢測TLR4 的定位和表達 石蠟切片4 μm厚, 脫蠟后3%過氧化氫液封閉過氧化物酶, 行微波抗原修復, 血清封閉, 再逐步加TLR4抗體, 生物素標記的羊抗鼠IgG及辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素(試劑盒購自Abcam公司), 最后經DAB溶液顯色。陰性對照除了用PBS代替抗TLR4抗體外, 所有步驟同上, 以細胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽性細胞。每張玻片隨機選擇20個視野(×200),利用圖像分析系統(HIPAS-2000)進行吸光度測量并自動轉換為A值, 每個標本的TLR4表達強度用20個視野的平均A值表示。

1.2.5統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件, 實驗數據以( x-±s)表示, 組間兩兩比較采用q檢驗, 各組間比較采用單因素方差分析, 以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1測定血BUN、Scr、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平變化 與假手術組比較, UUO組血BUN、Scr顯著性升高(P＜0.05)；與UUO組比較, 小劑量組和大劑量組顯著性下降(P＜0.05)；小劑量組和大劑量組間差異無統計學意義(P＞0.05)。各組間TC、TG、LDL差異無統計學意義(P＞0.05), 見表1。

2.2腎臟病理改變 HE染色中UUO組左側腎組織可見腎間質水腫、纖維化, 遠端腎小管與近曲小管均擴張, 部分萎縮壞死, 見大量纖維細胞增生和淋巴單核細胞浸潤出現腎間質纖維化, 但腎小球無明顯改變。低劑量阿托伐他汀組和大劑量阿托伐他汀組有輕度腎小管上皮萎縮, 腎小管擴張, 間質中有單核細胞浸潤, 腎間質纖維化程度明顯輕于UUO組。Masson染色顯示, 與假手術組比較, UUO組膠原面積百分比顯著性增多；與UUO組比較, 小劑量組和大劑量組膠原面積百分比顯著性下降(P＜0.05)；但兩治療組間差異無統計學意義(P＞0.05), 見表2。

表14組大鼠 BUN、Scr、TC、TG、LDL測定結果

表14組大鼠 BUN、Scr、TC、TG、LDL測定結果

注：與假手術組比較,aP＜0.05；與UUO組比較,bP＜0.05

組別BUN(mmol/ L)Scr(μmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)假手術組4.27±0.8147.53±6.121.44±0.260.69±0.20.46±0.03 UUO組10.67±2.32a103.4±12.19a1.39±0.340.71±0.090.53±0.06小劑量組6.84±2.05b83.59±7.46b1.24±0.280.68±0.040.49±0.07大劑量組7.01±2.08b79.98±11.42b1.29±0.190.62±0.070.41±0.05

表24組大鼠腎組織膠原沉積、TLR4表達水平和TNF-α含量的比較

表24組大鼠腎組織膠原沉積、TLR4表達水平和TNF-α含量的比較

注: 與假手術組比較,aP＜0.05; 與UUO 組比較,bP＜0.05

組別膠原面積百分比(%)TLR4TNF-α(μg/L )假手術組0.8 ±0.054.28 ±0.9534.35 ±9.15 U U O 組25.67 ±3.83a11.57 ±0.05a98.54 ±13.74a小劑量組19.37 ±4.32b8.54 ±1.59b69.58 ±10.04b大劑量組20.12 ±4.28b9.08 ±2.75b71.43 ±11.47b

2.3各組大鼠腎組織TLR4表達和TNF-α含量結果(見表2)TLR4在假手術組大鼠腎臟組織中主要分布在腎近曲小管、遠曲小管、集合管、腎間質區、腎血管等部位, 在腎小球系膜區也有一定的表達。UUO組大鼠TLR4在上述區域的表達顯著升高, 尤其以腎小管及腎間質區增加最為明顯。與假手術組比較, UUO組TLR4、TNF-α顯著性升高(P＜0.05)；與UUO組比較, 小劑量組和大劑量組顯著性下降(P＜0.05)；小劑量組和大劑量組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

Toll樣受體最早發現于果蠅胚胎中, 是識別病原微生物的跨膜受體家族, 在免疫應答的誘導和炎癥反應中發揮重要作用［3］。Toll樣受體的生物學功能有：①調理病原微生物的吞噬作用；②參與抗原提呈細胞(APC)對病原體的識別過程；③激發多種免疫應答基因的轉錄, 如某些炎癥性細胞因子、共刺激分子等；④促發胞內的殺菌機制。TLR4是TLR家族的重要成員, 定位于人染色體9q32-q33上, 它的天然配體是脂多糖(LPS)、脂質磷壁酸(LTA)、HSP(熱休克蛋白)60、HSP(熱休克蛋白)70等［4］。內源性配體能夠激活TLR4, 活化的TLR4及相關配體誘導核因子KB激活, 啟動白介素-1、白介素-6、白介素-8、白介素-12、TNF-α及CD80與CD86等基因的轉錄, 介導各種病原體的識別和免疫活化過程, 從而導致腎臟損傷［5,6］。Tsuboi N等在培養的腎小管上皮細胞研究中發現有TLR4 的表達, 受到LPS 刺激后,細胞TLR4表達增多, NF-κB活性增強, 最后產生相關細胞因子, 啟動免疫應答［7］。TNF-α是單核巨噬細胞產生的一種重要的細胞因子, 參與炎癥病變的多方面病理生理學變化,如何阻斷TNF-α是控制慢性炎癥的關鍵。本實驗結果表明, UUO大鼠腎組織TLR4和TNF-α明顯升高, 這與文獻結果一致。

阿托伐他汀是屬于HMG-coA(丙戊二酸輔酶A)抑制劑,是臨床上常見的降脂藥物。近年發現這類藥物除了降脂作用,還存在非降脂相關的腎保護作用。這主要表現為以下幾方面：①抗細胞增殖［8］：能抑制腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞、腎間質成纖維細胞, 血管平滑肌細胞等增殖；促進細胞凋亡,抑制細胞外基質的合成和分泌, 促進基質蛋白的降解［9］。②抗炎癥作用：抑制單核巨噬細胞在腎血管周圍和腎間質的浸潤, 抑制4型膠原的表達, 在細胞水平, 可以抑制炎癥細胞和腎臟固有細胞合成和分泌各種炎癥因子［10］。③調節免疫應答：作用于各種炎癥細胞的聚集、分化、增殖和分泌活動。本實驗發現, 小劑量和大劑量阿托伐他汀組的腎組織TLR4蛋白和TNF-α較UUO組顯著降低, 提示阿托伐他汀可能通過下調TLR4蛋白和TNF-α, 從而減輕炎癥反應, 延緩腎間質纖維化的發展。本研究還發現采用阿托伐他汀兩種劑量并未顯著影響大鼠血脂水平, 小劑量和大劑量組間TLR4蛋白和TNF-α無顯著性差異, 提示阿托伐他汀可以通過非降脂相關的機制延緩腎間質纖維化, UUO模型中阿托伐他汀改善腎間質纖維化的作用并無明顯的劑量依賴性。

綜上所述, 阿托伐他汀可以通過非降血脂機制延緩腎間質纖維化的進展, 這與下調TLR4和TNF-α途徑有著重要的聯系。這對早期防治腎間質纖維化有重要的臨床意義。

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116001 大連大學附屬中山醫院腎內科