MSC治療小鼠OB模型排斥反應的作用研究

史乾 李靜 范慧敏

·論著·

MSC治療小鼠OB模型排斥反應的作用研究

史乾 李靜 范慧敏

目的研究間充質干細胞(MSC)免疫抑制功能在治療小鼠閉塞性細支氣管炎(OB)中的作用。方法分離C57BL/6小鼠骨髓MSC, 建立小鼠氣管移植后OB反應模型, 移植當天給予MSC, 30 d后處死小鼠, 移植氣管HE染色, 觀察移植氣管急性排斥反應的發生情況。并用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測移植排斥相關炎癥因子的含量。結果MSC治療移植組與異系移植組相比, 排斥反應得到緩解, 與無排斥反應的同系移植對照組相似, 移植氣管管腔阻塞程度緩解。移植氣管ELISA檢測發現, MSC治療移植組小鼠體內炎癥因子IFN-g下降, 而抑炎因子白細胞介素-10(IL-10)上升。結論MSC能緩解小鼠氣管移植后OB反應, 并調節體內免疫狀態, 抑制炎癥。

間充質干細胞；閉塞性細支氣管炎；白細胞介素-10

肺移植和心肺聯合移植是治療多種終末期心肺疾病的重要措施, 盡管免疫抑制劑的廣泛使用能較為有效的防治急性期排斥, 然而其對慢性排斥的作用卻收效甚微。肺移植排斥最主要的慢性排斥反應表現為閉塞性細支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB), 是限制肺移植患者長期存活的主要原因［1,2］。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)被認為不但能分化成不同類型的細胞系, 而且具有免疫調節功能［3,4］。由于MSC具有低免疫原性等特點, 因此同種異體的MSC可逃逸宿主的免疫清除, 在細胞移植方面頗具優勢。因此本課題將利用小鼠原位氣管移植模型探討MSC干預肺移植后OB的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 近交系雄性C57BL/6小鼠, 體重20～25 g；近交系雄性BALB/c小鼠, 體重20～25 g。均購于上海斯萊克實驗動物有限公司［許可證號SCXK(滬)2007-0005］。飼養于同濟大學實驗動物中心無特定病原體(SPF)動物房。該實驗得到同濟大學附屬上海市東方醫院倫理委員會批準。分組為同系移植對照組：C57BL/6→C57BL/6, 8例；異系移植組：BALB/C→C57BL/6, 8例；MSC治療移植組：BALB/C→C57BL/6 + MSC輸注, 8例。

1.2小鼠原位氣管移植模型的建立

1.2.1供體手術 術前12 h禁食、禁水。1%戊巴比妥鈉溶液, 0.1 ml/10 g腹腔注射小鼠麻醉。供體頸前正中切口, 游離氣管, 取6個軟骨環長度氣管一段, 置4℃生理鹽水備用。

1.2.2受體手術 同供者, 頸前正中切口, 游離氣管。紗布吸干供體氣管后縫合尾側, 將供體氣管尾側同受體尾側氣管膜部正中處縫合打結, 分別于尾側氣管3、9、12點方位各縫合一針并打結, 對合整齊。相同方法縫合頭側氣管。將兩側頸部肌肉覆被移植氣管后縫合, 縫合皮膚。

1.3標本收集 移植術后30 d處死小鼠。取移植氣管約5個氣管環, HE染色后, 顯微鏡下觀察小鼠氣管病理切片, 通過QWin軟件分析組織圖片數據。

1.4ELISA檢測 取移植氣管約5個軟骨環, 加入500 μl PBS, 勻漿后離心取上清液, 使用eBioscience IL-10、IFN-g ELISA kit, 分別在酶標儀450 nm及570 nm處讀取吸光度。

1.5統計學方法 所得所有數據均采用SPSS13.0統計軟件處理。計量資料以均數±標準差)表示, 采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1體外分離培養MSC 骨髓培養法從C57BL/6小鼠的骨髓中分離MSC。骨髓細胞接種于塑料培養瓶后, 細胞在培養瓶散在分布, 呈圓形。24 h后就見有細胞貼壁。72 h首次全量換液去除未貼壁細胞, 此時貼壁細胞胞體明顯增大并開始分裂增殖, 細胞形態漸變為梭形或紡錘形。流式細胞術檢測各分子的表達水平, CD105(96.1±8.5)%、CD29(97.7±9.5)%、SCA-1(96.3±10.7)%, CD45(2.34±1.5)%, CD11b(1.41±0.7)%。該群細胞不表達CD45和CD11b, 高表達CD105、CD29和SCA-1。符合小鼠骨髓來源間充質干細胞的表型特點。進而在分化功能檢測中, 作者發現這些細胞可以分化成為脂肪細胞和成骨細胞。

2.2MSC輸注治療OB模型排斥反應效果 各標本可見各組小鼠氣管吻合口均愈合良好, 無嚴重狹窄。同系移植對照組小鼠移植氣管與周圍結締組織粘連較輕, 氣管形態接近正常, 管壁可見柱狀上皮細胞及纖毛, 管壁內未見炎性細胞浸潤或管腔閉塞。而異系移植組小鼠移植氣管與周圍結締組織粘連較重, 可見黏膜水腫、糜爛, 及上皮纖毛脫失, 內膜增厚明顯, 伴隨大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤, 提示存在免疫排斥反應。術后30 d病理學染色結果顯示體外培養的MSC培養2代后進行過繼輸入作為MSC治療移植組, 與異系移植組對比, MSC治療移植組炎性細胞浸潤明顯減輕, 內膜增厚程度明顯輕于異系移植組。見圖1。

圖1 小鼠原位氣管移植1個月后氣管病理切片

2.3MSC對移植模型體內炎癥狀態影響 為分析MSC如何緩解OB排斥反應, 作者檢測各組模型體內的炎癥因子水平,評價MSC對免疫系統的作用。通過ELISA方法檢測移植物局部抑炎因子IL-10和促炎因子IFN-g水平, 作者發現MSC治療移植組IL-10水平與其他兩組比較明顯升高(P＜0.05), 而IFN-g水平下降(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組移植氣管炎癥因子檢測分析結果

3 討論

肺移植是治療終末期肺臟疾病唯一有效的方法［5］。盡管近些年來新的抗移植排斥藥物的應用, 以及外科技術的改進使得肺移植術成功率明顯增加, 但肺移植術后患者的長期存活率依然很低, 而肺移植后的慢性排斥反應是患者長期生存的主要障礙, 使肺移植患者5年生存率低于50%。因此,探索有效的預防和治療肺移植術后OB的策略尤為重要。

近年的研究發現, 除了多向分化潛能之外, 免疫調節功能也是MSC的重要功能之一。體內研究［6］發現MSC能通過改變T淋巴細胞和樹突狀細胞(DC)的遷移能力改善急性移植物抗宿主病(GVHD)。同時, MSC能有力地下調其表面CD11c、CD80、CD86及CD40的表達, 上調CD11C的表達,細菌脂多糖(LPS)不能逆轉此改變, 而且這種MSC處理的DC具有較高的胞吞能力、低免疫源性和較強的免疫調節功能［7］。

MSC可通過細胞接觸, 或者通過其產生的細胞因子發揮免疫調節功能［8］。盡管在體內研究中, 作者發現過繼輸入MSC明顯增加了體內IL-10的表達。本研究通過建立小鼠原位氣管移植模型, 于術后第30天排斥反應期檢測移植氣管病理變化及相關炎癥因子的含量, 探討MSC在移植后OB反應中的作用。作者發現MSC過繼輸入到小鼠OB模型的體內,可明顯減輕氣管移植物的病理改變, 并緩解移植氣管阻塞的程度。進一步對移植氣管炎癥因子的含量測定發現, MSC治療小鼠后, 移植氣管IL-10明顯升高, IFN-g降低, 提示了MSC能調節免疫狀態抑制排斥。因此, 研究為深入探索MSC發揮免疫調節作用的機制并將這群細胞用于臨床奠定一定的實驗基礎。在后續試驗中, 作者將進一步在大動物OB模型中驗證MSC治療排斥反應的有效性和可靠性, 為臨床轉化應用提供理論基礎。

［1］ Hardy JD, Wobb WR , Dalton ML Jr, et al.Lung Homotransplantaion in man.JAMA, 1963:186.

［2］ 范慧敏, 劉中民, 郭建華, 等.心肺聯合移植治療艾森曼格綜合征4例.中華器官移植雜志, 2006, 27(5):294-296.

［3］ Zappia E, Casazza S, Pedemonte E, et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy.Blood, 2005, 106(5):1755-1761.

［4］ Peister A, Mellad JA, Larson BL, et al.Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential.Blood, 2004,103(5):1662-1668.

［5］ Casiraghi F, Azzollini N, Cassis P, et al.Pretransplant Infusion of Mesenchymal Stem Cells Prolongs the Survival of a Semiallogeneic Heart Transplant through the Generation of Regulatory T cells.Journal of immunology, 2008,181(6):3933-3946.

［6］ Mao F, Xu W, Qian H, et al.Immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells in collagen-induced mouse arthritis.Inflamm Res, 2010,59(3): 219-225.

［7］ Cao H, Lan Q, Shi Q, et al.Anti-IL-23 antibody blockade of IL-23/ IL-17 pathway attenuates airway obliteration in rat orthotopic tracheal transplantation.Int Immunopharmacol, 2011, 11(5):569-575.

［8］ Burlingham WJ, Love RB, Jankowska-Gan E, et al.IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants.The Journal of clinical investigation, 2007,117(11):3498-3506.

Effect study of rejection of MSC in treatment of mice OB model

SHI Qian, LI Jing,
FAN Hui-min.Department of Cardiac surgery, Shanghai East Affiliated Hospital of Tongji University/Institute of Cardiac Failure, Shanghai 200120, China

ObjectiveTo analyze the effect of immunosuppression of mesenchymal stem cell (MSC) in the treatment of mice obliterans bronchiolitis (OB).MethodsMarrow MSC of C57BL/6 mice was separated to set OB reaction model after trachea transplantation of mice.MSC was given on the day of transplantation.The mice were put to death after 30 days.HE staining was used on the transplanted trachea, and the situation of acute rejection of transplanted trachea was observed.Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was applied to detect the content of inflammatory factors related to transplant rejection.ResultsRejection reaction in MSC transplant group was eased, compared with different system transplant group, and degree of lumen obstruction in transplanted trachea was also eased, compared with allografts transplant control group without rejection.ELISA test for transplanted trachea showed that inflammatory factor IFN-g decreased in MSC transplant group, while anti-inflammatory factor interleukin-10 (IL-10) increased.ConclusionMSC can ease the OB reaction after trachea transplantation, adjust immune state and inhibit inflammation.

Mesenchymal stem cell; Obliterans bronchiolitis; Interleukin-10

2014-07-23］

國家自然科學基金項目(項目編號：81200062, 31200678)；上海市衛生局青年科研項目(項目編號：20114Y148)

200120 同濟大學附屬上海市東方醫院心外科, 心力衰竭研究所

范慧敏