營養不良對仔鼠胰島素和nestin蛋白水平的影響

袁可 陳玉鳳 張立生

·實驗研究·

營養不良對仔鼠胰島素和nestin蛋白水平的影響

袁可 陳玉鳳 張立生

目的連續觀察營養不良仔鼠生后血糖、血清胰島素的水平, 并檢測其胰腺組織中insulin(胰島素)和nestin(巢蛋白)mRNA表達水平, 探討營養不良在仔鼠胰腺發育過程中的影響。方法用低蛋白飲食法低出生體重仔鼠的模型, 實驗組(R組)母鼠在21 d哺乳期繼續低蛋白飲食喂養；對照組(C組)母鼠給予正常蛋白飲食喂養。仔鼠出生1、7、14、21 d采血監測血糖和血清胰島素值；RTPCR檢測胰島素和nestin mRNA水平的表達。結果各時間點：①R組仔鼠體重均低于C組；②血糖和血清胰島素水平差異無統計學意義(P＞0.05)；③R組胰腺中胰島素和nestin mRNA水平均低于C組,差異有統計學意義(P＜0.05)。結論宮內營養不良可導致仔鼠低體重, 生后早期其血糖和血清胰島素水平雖然較對照組相比尚無改變, 但胰腺中胰島素含量已發生明顯的改變, β細胞的再生減少可能是其機制。

營養不良；胰島素；nestin蛋白

近些年來不斷有流行病學資料和動物實驗研究表明：出生時體重偏低者在成年后發生糖耐量減低和II型糖尿病的風險顯著增加。因此研究胎兒生長與成年期疾病的潛在機制成為圍產醫學和新生兒學的研究熱點。作者連續觀察營養不良仔鼠生后血糖、血清胰島素的水平, 并檢測其胰腺組織中insulin和nestin mRNA表達水平, 探討營養不良在仔鼠胰腺發育過程中的影響。

1 材料與方法

1.1動物模型 使10只健康的三月齡SD雌鼠受孕成功,之后隨機分為兩組：實驗組(R組)自受孕成功后開始10%低蛋白飼料喂養, 并持續喂養至在仔鼠出生后21 d；對照組(C組)自受孕成功后給予正常蛋白飼料喂養。

1.2方法

1.2.1體重、血糖和血清胰島素測定 各組仔鼠于生后1、7、14、21 d稱重后斷頭取血, 測定血糖, 余血樣放射免疫法測血清胰島素水平。

1.2.2mRNA定量分析 完整分離生后第1、7、14、21天的兩組仔鼠的胰腺組織, 提取總RNA, 逆轉錄合成cDNA。在同一反應體系內PCR擴增cDNA, insulin產物為236 bp；nestin產物為283 bp。內對照GAPDH產物451 bp。將擴增成功的cDNA產物加入瓊脂糖凝膠后進行電泳, 再利用凝膠成像分析系統掃描, 獲得的不同的OD值, 最后用insulin和nestin與GAPDH 的OD比值, 將insulin和nestin mRNA的表達情況進行半定量分析。

1.3統計學方法 采用SPSS12.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

隨出生日齡的增加：①R組仔鼠的體重和C組仔鼠一樣在不斷增加, 但在各個時間點均顯著低于C組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；②R組仔鼠的空腹血糖和血清胰島素水平無顯著變化, 且與C組比較差異無統計意義(P＞0.05)；③兩組仔鼠的胰腺組織中胰島素和nestin mRNA表達均逐步增加,在每個時間點, R組的表達量均顯著低于C組, 差異有統計學意義(P＜0.05)。 Insulin mRNA和nestin mRNA含量呈正相關,在R組兩者相關系數r為0.674(P=0.013), C組兩者的相關系數r為0.775(P=0.002)。見表1。兩組仔鼠第21天時insulin和nestin mRNA電泳結果, 見圖1。

圖1 兩組仔鼠第21天時胰腺insulin 和nestin mRNA

表1兩組仔鼠不同時間點體重、insulin 和nestin mRNA的比較n=6)

表1兩組仔鼠不同時間點體重、insulin 和nestin mRNA的比較n=6)

注：與對照組(C組)比較,aP＜0.05

指標第1天 postnatal day 1第7天 postnatal day 7第14天 postnatal day 14第21天 postnatal day 21 R組C組R組C組R組C組R組C組Body weighy (g) 6.44±0.22a7.08±0.4110.48±0.82a14.33±0.6616.86±2.39a27.01±2.1323.01±3.14a45.32±7.59 insulin mRNA0.532±0.047a0.723±0.0390.607±0.094a0.797±0.0750.675±0.048a0.854±0.1020.734±0.110a0.918±0.057 nestin mRNA0.204±0.007a0.263±0.0140.243±0.013a0.357±0.0280.267±0.025a0.414±0.0110.298±0.014a0.475±0.046

3 討論

針對Pima印地安人的一項流行病學研究發現：出生體重與成年后糖尿病發生率存在U形關系, 即低出生體重者較高出生體重者具有更高的糖尿病發生率(25.0% VS 18.2%)。米杰等［1］的一項針對中國人的流行病學研究也顯示出生時的營養不良是其成年期發生II型糖尿病的獨立危險因素。關于營養不良與發生成年期疾病的潛在機制, Lucas首先在1998年提出“營養程序化［2］”概念, Wzanne在2001年進一步提出“代謝程序化［3］”概念。他們認為：在出生早期機體會對營養不良產生適應性反應, 導致胰島的內分泌功能和結構在生命早期即發生潛在的改變, 這種不易覺察的改變將持續至成年期, 最終導致2型糖尿病易患性增加。1999年的一項研究發現低出生體重兒可最早在7歲時檢測到糖耐量異常［4］。

圍產期發育中的許多器官存在重構(remodeling), 即圍生期組織細胞的凋亡、增殖和再生均處于較成年期的高水平,此后至成年期該組織細胞的凋亡、增殖和再生水平顯著下降, 其總數量或比例基本確定。Scaglia等［5］實驗發現大鼠的胎兒期至生后21 d(相當于人類胎兒至哺乳期)是大鼠胰島重構的關鍵時期, 此后胰島的結構和功能將被“程序化”,將對血糖的自穩態產生終生的影響。本實驗動態觀察了生后21 d內營養不良組仔鼠血糖和血清胰島素水平, 顯示其尚能保持正常水平, 未出現胰島素抵抗, 但是胰腺中的胰島素含量已經出現減少。Nestin是一種在胚胎時期高度表達的中間絲蛋白, 現被公認為是神經干細胞或前體細胞的標志物之一。2000年, Hunziker等［6］首先報道在胰島中也存在nestin 陽性細胞, 體外實驗則發現, nestin陽性的胰腺導管細胞可在體外誘導分化為具有分泌胰島素功能的β細胞［7］。因此從nestin陽性的內分泌前體細胞到新生β細胞的分化過程是胰島重構的重要環節。本研究結果顯示營養不良組仔鼠的胰腺組織中nestin mRNA含量雖隨日齡緩慢上升, 但均顯著低于同日齡的對照組, 且與insulin mRNA水平呈正相關。故推測營養不良可能使仔鼠胰腺中內分泌前體細胞數量下降, 從而損害了β細胞的分化, 改變了仔鼠胰島重構、最終使胰腺中胰島素含量下降。

新生兒期營養狀況對胰腺β細胞的發育至關重要。本研究發現營養不良的仔鼠在生后21 d內, 血糖和血胰島素水平尚未出現異常, 但其胰腺組織中insulin和nestin mRNA表達量已下降。因此在臨床工作中遇到低出生體重新生兒時, 不僅要關注血糖、血清胰島素水平等血液指標有無異常的表面現象, 更要預見到低出生體重新生兒的胰島β細胞發育可能已經受損。如果不能及時有效的改善其營養狀況, 將可能使得β細胞再生減少, 影響胰島正常發育, 進而導致其成年期II型糖尿病的發生。因此, 在胎兒、特別是生后早期這個胰島重構的敏感時期尋求一種有效的方法, 對低出生體重新生兒進行積極有效的早期干預, 將有望改善胰島重構, 最終達到成年期疾病生后早期防治的目的。

［1］ 米杰, 程紅, 趙小元, 等.出生重量指數對中年罹患代謝綜合征的預測作用.中華預防醫學雜志, 2004, 38(4):221-225.

［2］ McMillen IC, Edwards LJ, Duffield J, et al.Regulation of leptin synthesis and secretion before birth: implications for the early programming of adult obesity.Reproduction, 2006, 131(3):415-427.

［3］ Reusens B, Remacle C.Programming of the endocrine pancreas by the early nutritional environment.Int J Biochem Cell Biol, 2006, 38(5-6): 913-922.

［4］ Hoet JJ, Hanson MA.Intrauterine nutrition: Its importance during critical periods for for cardiovascular and endocrine development.J Physiol, 1999, 514(Pt3):617-627.

［5］ Scaglia L, Cahill CJ, Findgood DT, et al.Apoptosis participates in the remodeling of the endocring pancreas in the neonatal rat.Endocrinology, 1997, 138(4):1736-1741.

［6］ Hunziker E, Stein M.Nestin-expressing cells in the pancreatic islets of langerhans.Biochem Biophys Res Commun, 2000(271):116.

［7］ Kim SY, Lee SH, Kim BM, et al.Activation of nestin-positive duct stem (NPDS) cells in pancreas upon neogenic motivation and possible cytodifferentiation into insulin-secreting cells from NPDS cells.Dev Dyn, 2004, 230(1):1-11.

2014-07-24］

266000 青島市婦女兒童醫院新生兒重癥監護室(袁可 張立生)；新鄉市中心醫院內分泌科(陳玉鳳)