紫外分光光度法測定犬血漿中美沙拉嗪的藥物濃度

牛青梅 周慶頌 孫若飛

紫外分光光度法測定犬血漿中美沙拉嗪的藥物濃度

牛青梅 周慶頌 孫若飛

目的建立測定犬血漿中美沙拉嗪濃度的紫外分光光度法(UV)。方法以5%三氯乙酸沉淀蛋白, 在紫外吸收波長303 nm處測定吸光度值。結果回歸方程為Y=0.0051X+0.0277(r=0.9997),線性范圍40～160 μg/ml；美沙拉嗪低、中、高3種濃度方法回收率分別為(97.16±2.37)%、(98.92±1.84)%、(98.41±2.29)%；日內精密度RSD分別為2.17%、1.75%、2.21%, 日間精密度RSD分別為1.88%、1.68%、1.63%。結論紫外分光光度法簡單、準確、成本低, 為后續開展相關研究奠定了基礎。

紫外分光光度法；血藥濃度；美沙拉嗪

美沙拉嗪(5-ASA)是治療潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和節段性回腸炎(克羅氏病, crohn's disease, CD)的主要藥物之一［1］。目前美沙拉嗪血藥濃度測定方法基本是采用高效液相色譜法(HPLC), 但是HPLC法測定5-ASA血藥濃度的方法前處理復雜, 對儀器要求較高, 而一些體外藥物代謝動力學實驗, 如血漿蛋白結合率測定、離體(或在體)腸吸收實驗等采用HPLC法進行藥物濃度測定非常不便。作者采用UV法, 以5%三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白后建立了測定犬血漿中5-ASA濃度的方法。該方法具有專屬性強、血漿用量少、準確、快捷方便等特點, 適用于一些體外藥物代謝動力學試驗中5-ASA藥物濃度的測定。

1 材料與方法

1.1材料 UV-2550紫外分光光度計(日本島津)；XS205 Dualrange電子天平(瑞士METTLER, 精度十萬分之一)；Vortex Genie2 渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)；ANKE TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；5-ASA對照品(上海金錦樂股份有限公司, 純度＞98%), 犬血漿(北京平睿生物科技有限公司), 三氯乙酸(天津大茂化學試劑廠, 純度＞99%), 其他試劑均為分析純, 實驗用水為雙蒸水。

1.2方法

1.2.1美沙拉嗪系列標準溶液配制

1.2.1.1pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)的配制 精密稱取磷酸氫二鉀14.11 g, 磷酸二氫鉀2.59 g, 氯化鈉1.99 g, 定容至1000 ml即得。

1.2.1.2系列標準溶液配制 精密稱取5-ASA對照品160 mg, 置于100 ml量瓶中, 用PBS緩沖液稀釋至刻度, 得質量濃度為1.60 mg/ml的標準貯備液。分別用PBS緩沖液稀釋配制成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/ml的標準系列溶液,冷藏保存。

1.2.2血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品800 μl, 置5 ml離心管中, 加入PBS緩沖液, 旋渦混合30 s后加入蛋白沉淀劑(5%三氯乙酸溶液)800 μl, 旋混1 min, 10000 r/min離心15 min, 取上清液, 經0.45 μm微孔濾膜過濾后取續濾液, 即得。

1.2.3方法專屬性及測定波長的選擇 取空白血漿、含藥(5-ASA)血漿分別經“1.2.2”項方法處理后對其進行紫外光譜全掃描, 結果見圖1。光譜對比表明血漿中內源性物質在檢測波長303 nm處無干擾, 專屬性良好, 因此選擇303 nm作為測定波長。

圖1 血漿樣品UV掃描圖譜(A含藥血漿；B空白血漿)

1.2.4標準曲線的制備 精密吸取空白血漿800 μl, 置5 ml離心管中, 分別加入“1.2.1”項下制備的不同質量濃度的5-ASA系列標準溶液80 μl, 旋渦混合30 s, 得到含5-ASA濃度分別為40、60、80、100、120、140、160 μg/ml的血漿樣品。按“1.2.2”項下方法處理；同時取空白血漿800 μl, 加入80 μl PBS緩沖液, 同法處理作為空白；按照UV法［1］, 在303 nm波長處測定吸光度, 以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.5方法回收率與精密度 分別于800 μl的空白血漿中加入低、中、高3種濃度(600、1000、1400 μg/ml)的5-ASA對照品溶液80 μl, 混勻, 得低、中、高3種不同濃度美沙拉嗪的血漿樣品, 按“1.2.4”項下方法處理并測定, 將5-ASA的吸光度值代入標準曲線計算5-ASA 血藥濃度, 以測得值與加入值之比計算方法回收率。以1 d內測得的5-ASA濃度計算日內精密度, 以1周內5次測定的5-ASA濃度計算日間精密度。

1.3統計學方法 采用 DAS2.0藥物代謝動力學軟件進行統計分析。相關結果比較采用回歸分析。

2 結果

2.1標準曲線方程 標準曲線試驗數據如表1所示, 回歸方程為：Y=0.0051X+0.0277, 相關系數r=0.9997, 美沙拉嗪在40～160 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.2回收率及日內精密度 回收率及日內精密度試驗結果如表2所示。低、中、高3種質量濃度的平均方法回收率分別為(97.16±2.37)%、(98.92±1.84)%、(98.41±2.29)%(n = 6)。低、中、高3 種質量濃度的日內RSD分別為2.17%、1.75%、2.21%。

2.3日間精密度試驗 1周內連續5個工作日測定所得日間精密度, 結果如表3所示。低、中、高3 種質量濃度的日間RSD分別為1.88%、1.68%、1.63%。

表1不同濃度美沙拉嗪血漿UV測定結果(n=3)

表2回收率及日內精密度試驗結果(n=6)

表3日間精密度試驗結果(n=6, d=5)

3 討論

本試驗選取5%三氯乙酸溶液直接沉淀蛋白的方法測定5-ASA 血藥濃度。該方法簡化了樣品預處理過程, 可在短時間內處理大批樣品, 具有簡便迅速, 蛋白清除完全, 靈敏度及回收率高的特點。由于三氯乙酸的酸性較大, 加入后使5-ASA吸收波長藍移, 其最大吸收波長由330 nm變為303 nm。測定過程中作者采用空白血漿按含藥血漿相同方法進行處理作為空白對照, 能有效去除血漿中內源性物質對測定的干擾［3］。本試驗所得標準曲線線性范圍為40～160 μg/ml, 基本能夠滿足大部分體外藥物代謝動力學試驗的測定需要。

［1］ 劉偉.潰瘍性結腸炎的藥物治療現狀與前景.國外醫學(消化系疾病分冊), 2003, 23(5):261-263.

［2］ 國家藥典委員會.中國藥典(二部).北京: 中國醫藥科技出版社, 2010:30-31.

［3］ 熊鳳英, 簡潔, 周淑群, 等.紫外分光光度法測定米非司酮血藥濃度.中國醫院藥學雜志, 2008, 18(6):262-263.

The Determination of mesalazine in dog plasma by UV-spectrophotometry

NIU Qing-mei, ZHOU Qingsong, SUN Ruo-fei.
School of Pharmacy, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China

ObjectiveTo establish UV-spectrophotometry (UV) method for the determination of mesalazine in dog plasma.MethodsSerum protein was precipitated with 5% trichloroacetic acid, and the absorbance value at 303 nm was detected.ResultsThe regression equation was Y=0.0051 X+0.0277 (r=0.9997), and the linear response range was 40～160 μg/ml.The recovery rates of mesalazine in three different concentrations were (97.16±2.37)%, (98.92±1.84)%, (98.41±2.29)% respectively.The RSD of intra-day precision was 2.17 %, 1.75%, 2.21%.The RSD of inter-day precision was 1.88 %, 1.68 %, 1.63 % respectively.ConclusionThe UV method is simple, accurate and low-cost, which can lay the foundation for the further research.

UV-spectrophotometry; Blood concentration; Mesalazine

2014-08-08］

國家自然科學基金項目(項目編號：81160397)

330013 江西科技師范大學藥學院

周慶頌