應(yīng)用宏基因組技術(shù)從微生物中獲得活性物質(zhì)的研究進(jìn)展

摘要：采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的篩選方法，地球上99%以上的微生物還沒能被人類開發(fā)生產(chǎn)活性物質(zhì)，這使得自然界中微生物資源的開發(fā)利用受到極大限制。宏基因組文庫技術(shù)的應(yīng)用避開了微生物純培養(yǎng)的問題，極大拓展了微生物資源的利用空間，目前被廣泛應(yīng)用于各種新的酶及活性物質(zhì)的研究。在重點(diǎn)介紹宏基因組文庫的構(gòu)建及篩選方法等，以及宏基因組技術(shù)在微生物活性物質(zhì)篩選中應(yīng)用的基礎(chǔ)上，對宏基因組研究存在的問題進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞：宏基因組文庫；微生物；活性物質(zhì)；篩選

中圖分類號： Q789文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0005-03

收稿日期：2013-05-24

作者簡介：高岳（1979—），男，江蘇蘇州人，博士，講師，從事生物工程及微生物天然產(chǎn)物研究。Tel：（0512）66098727；E-mail：gaoyue0605@163.com。環(huán)境當(dāng)中有超過99%的微生物不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，大多數(shù)微生物還沒能被人類用來開發(fā)生產(chǎn)可能的有用產(chǎn)物[1-2]。用傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法沒有辦法對不可培養(yǎng)微生物的酶及其產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，但是，通過“宏基因組學(xué)”研究方法，可以直接從環(huán)境樣品中提取微生物DNA，讓微生物DNA在易培養(yǎng)宿主中克隆表達(dá)[3]。從自然界微生物群落中直接提取DNA后建立宏基因組文庫，然后進(jìn)行克隆篩選，目前被廣泛應(yīng)用于各種新的酶及活性物質(zhì)的研究。

1宏基因組學(xué)的概念

1998年，Handelsman等首次提出了宏基因組（metagenome）的概念，是指特定環(huán)境中全部微生物基因的總和。宏基因組學(xué)（metagenomics）是一種新的微生物研究方法，它以環(huán)境樣品中微生物群體基因組為研究對象，通過基因篩選和序列分析等手段，來研究環(huán)境微生物的功能活性、多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系，以及它們與環(huán)境之間的關(guān)系。宏基因組文庫包含了可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物基因的總和，不需要使用傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)，極大地拓寬了微生物資源的利用空間，為獲得新的酶及生物活性物質(zhì)提供了更廣闊的平臺。

2宏基因組文庫的構(gòu)建

2.1DNA提取

DNA提取方法主要有2種：一種是直接（原位）裂解法，直接裂解環(huán)境樣品中的微生物細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提。這種方法操作簡單、成本較低、DNA獲得率比較高，也更具有代表性；但提出的DNA片段較小（1～50 kb），且用這種方法容易殘留環(huán)境樣品中的雜質(zhì)，如腐殖酸、棕黃酸等，這些雜質(zhì)對后續(xù)的PCR擴(kuò)增等操作會產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。另一種是間接（異位）裂解法，即先采用差速離心等物理手段，將微生物細(xì)胞從環(huán)境樣品中分離出來，再用較溫和的方法來對DNA進(jìn)行抽提。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得大片段DNA（20～500 kb），而且純度高、雜質(zhì)殘留少；但這種方法操作繁瑣，成本較高，DNA 獲得率比較低，且用此法抽提到的DNA主要來自于和土壤顆粒附著力較弱的微生物個體。因此，要根據(jù)研究手段及目的基因的大小，選擇合適的提取方法。Liles等證明了用甲酰胺高鹽溶液處理的樣品能夠提取大片段DNA，并能有效地提高宏基因組文庫的構(gòu)建效率，這為獲取完整的大片段DNA提供了可借鑒的方法[4]。

2.2文庫構(gòu)建

從環(huán)境樣品中提取DNA，用于構(gòu)建宏基因組文庫，進(jìn)而篩選各種活性物質(zhì)。在構(gòu)建文庫時，應(yīng)根據(jù)自身的研究目的和獲得的DNA的量、純度、片段大小等來選擇載體和宿主。

載體的選擇需要考慮載體的大小、載體拷貝數(shù)、插入片段的大小、所用宿主及篩選方法等因素[5]。常用的克隆載體包括質(zhì)粒（plasmid，插入片段10 kb以下）、黏粒（cosmid，插入片段40 kb左右）和細(xì)菌人工染色體（BAC，插入片段可達(dá) 350 kb）等，可滿足不同的插入片段大小要求。BAC 載體可以克隆大片段的DNA，增加了獲得完整的指導(dǎo)大分子活性物質(zhì)合成途徑的編碼基因或基因簇的機(jī)會，在宏基因組克隆表達(dá)中具有一定的優(yōu)勢。Gillespie等用細(xì)菌人工染色體載體pBeloBACⅡ構(gòu)建了2個土壤樣品的宏基因組BAC文庫，獲得了2 個具有廣譜抗菌作用的新抗生素turbomycin A和 turbomycin B 及其合成酶基因簇[6]。

宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、外源基因的表達(dá)、目標(biāo)性狀篩選等因素[5]。研究結(jié)果表明，不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型有明顯差異，因此，可根據(jù)不同研究目標(biāo)選擇不同的宿主菌株，如70%的抗生素來源于放線菌，若尋找抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)，應(yīng)選擇鏈霉菌為宿主菌，而大腸桿菌則主要用于新型酶的篩選等[7]。大腸桿菌作為成熟的基因克隆表達(dá)受體細(xì)胞，仍然是研究宏基因組的首選宿主菌，如紫色桿菌素（violacein）C等在大腸桿菌中的成功表達(dá)[8]。鏈霉菌屬編碼次生代謝產(chǎn)物合成的基因以基因簇的形式存在，表達(dá)受到細(xì)胞信號交流和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，具備天然抗生素產(chǎn)生機(jī)制[9]。

3活性物質(zhì)文庫的篩選

采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行生物活性物質(zhì)篩選時，一般都是獲得相應(yīng)的混合物，然后還需要進(jìn)行活性化合物分離、提純和鑒定等一系列后續(xù)處理。高品質(zhì)的活性物質(zhì)分析需要培養(yǎng)或發(fā)酵，產(chǎn)生某種活性物質(zhì)的細(xì)菌，在發(fā)酵時其合成能力可能會降低，甚至喪失。應(yīng)用宏基因組技術(shù)進(jìn)行篩選時，由于合成該物質(zhì)的基因攜帶在一定載體上，其功能基本不會丟失。活性物質(zhì)文庫篩選是細(xì)菌之間通用某些功能基因及其表達(dá)調(diào)控子，克服了發(fā)酵限制，優(yōu)越于傳統(tǒng)篩選。基于環(huán)境宏基因組的高度復(fù)雜性，必須有高通量、高靈敏度的方法來篩選和鑒定文庫中的目標(biāo)基因或活性分子。應(yīng)用宏基因組技術(shù)篩選活性物質(zhì)時，根據(jù)目的不同，可從以下不同水平設(shè)計不同的篩選方案。

3.1序列驅(qū)動篩選

序列驅(qū)動篩選是指根據(jù)已知的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的保守序列設(shè)計探針或PCR引物，通過核酸雜交或PCR擴(kuò)增，篩選具有目標(biāo)序列的克隆子，以獲得某一類結(jié)構(gòu)或功能類似的蛋白質(zhì)新分子或其編碼基因[10-11]。來自海綿具有藥用價值的天然產(chǎn)物大多數(shù)是復(fù)雜的聚酮類化合物，海綿宏基因組編碼許多指導(dǎo)不同途徑的聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）[12-13]。PKS包括1個或多個模塊，每個模塊都至少包括3個結(jié)構(gòu)域：酮體合成酶（ketosynthase，KS）、酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl transferase，AT）、酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP），其中，KS編碼區(qū)同源性最高，因此，可以根據(jù)KS結(jié)構(gòu)域的保守序列設(shè)計PCR引物[12-14]，從海綿宏基因組文庫中篩選攜帶PKS基因的克隆。Courtoi等構(gòu)建了1個可以在大腸桿菌和鏈霉菌間轉(zhuǎn)移的穿梭Cosmid載體，并以此構(gòu)建了1個土壤宏基因組文庫，通過序列驅(qū)動篩選獲得了新的抗腫瘤活性物質(zhì)聚酮的合成酶基因簇[15]。序列篩選法的優(yōu)點(diǎn)是不必依賴外源基因在宿主中的表達(dá)，但它無法篩選宏基因組文庫中那些和現(xiàn)有基因序列完全不同的新基因，因此較難發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)。不過，Gupta等認(rèn)為，當(dāng)宏基因組文庫基因的保守序列與數(shù)據(jù)庫中已知基因的保守序列相似度低于40%時，基于序列的篩選策略也可能篩選到新的功能產(chǎn)物[16]。

3.2功能驅(qū)動篩選

功能驅(qū)動篩選主要通過化學(xué)等手段，從宏基因組文庫中檢測表達(dá)目標(biāo)活性物質(zhì)的克隆子，這種方法具有較高靈敏度，產(chǎn)色素的陽性克隆在平板上呈現(xiàn)的顏色不同，可以被快速篩選出來，如Huang等從構(gòu)建的中國南海深海沉積物Fosmid宏基因組文庫中篩選到了產(chǎn)黑色素（melanin）的克隆[17]；或是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條件下功能互補(bǔ)生長的特性進(jìn)行篩選[18]。Hu等在1個南極荒漠土壤宏基因組文庫中，使用含有底物甘油三酸酯三丁酸甘油酯的瓊脂平板篩選到1種新的酯酶[19]。Neveu等從戈壁和死亡谷沙漠宏基因組文庫中，在用脫脂牛奶作為底物的平板上分離到2個絲氨酸蛋白酶[20]。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能找到各種新的酶及活性物質(zhì)，但它受限于基因必須能在宿主中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能夠正常溶解，并且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要能夠正確地折疊。然而，很多克隆的外源基因并不能在新的遺傳背景中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

3.3功能篩選法的改進(jìn)

宏基因組文庫在進(jìn)行功能篩選時，存在諸多問題，需要對宿主及載體系統(tǒng)進(jìn)行改造及完善，改進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)，從而解決宏基因組基因在多宿主系統(tǒng)中的表達(dá)問題，如：可采用穿梭載體，使其在不同宿主中進(jìn)行目的基因的表達(dá)，或是對大腸桿菌進(jìn)行改造，擴(kuò)大它對基因的表達(dá)范圍。目前，宏基因組文庫的構(gòu)建常采用的表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌和鏈霉菌，可以通過綜合考慮宿主的天然生物合成能力和它對外源啟動子的傾向性，拓展新的宿主菌用于宏基因組的研究。Craig等以R. metallidurans為克隆宿主，成功獲得了土壤eDNA 的編碼產(chǎn)物，其中有2個是新天然產(chǎn)物，他們還進(jìn)一步驗(yàn)證了獲得的產(chǎn)物在大腸桿菌中不能表達(dá)或無法被檢測到表達(dá)，進(jìn)而證明了Ralstonia metallidurans可以作為宏基因組學(xué)文庫新的模式系統(tǒng)，用于發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)物[21]。另外，還可結(jié)合其他相關(guān)技術(shù)來改進(jìn)功能篩選法，如在克隆前運(yùn)用超速離心法、密度梯度離心法、穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)等[22-23]，對樣品中感興趣的基因或基因組進(jìn)行富集，從而提高陽性克隆的比例。將親和篩選技術(shù)和噬菌體表面展示表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合起來分離DNA，是一個高效易控制的高通量篩選方法，在宏基因組文庫中即使是稀少的DNA序列也可得到富集，有利于文庫中稀有DNA序列的表達(dá)[24]。

4部分微生物活性物質(zhì)篩選情況

利用宏基因組技術(shù)篩選活性物質(zhì)被證實(shí)是一種行之有效的方法，其效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他方法并且具有廣闊的前景，是基因工程研究的一個主要方向。目前，研究人員已經(jīng)利用功能和序列為基礎(chǔ)的方法通過宏基因組篩選，鑒定了比較多的新型酶及抗菌活性物質(zhì)（表1），潛在的工業(yè)開發(fā)利用價值很大。

表1宏基因組文庫篩選的活性物質(zhì)

活性物質(zhì)1文獻(xiàn)β-半乳糖苷酶1Wang等[25] ，2010鞣酸酶1Yao等[26]，2011α-淀粉酶1Liu等[27]，2012內(nèi)切葡聚糖酶1Pang等[28]，2009內(nèi)酯酶1Schipper等[29] ，2009DNA聚合酶1Simon等[30]，2009ATP酶1de la Iglesia等[31]，2010糖肽基因1Banik 等[32]，2008核糖體環(huán)肽1Sivonen等[33]，2010抗癌物patellamide基因1Long等[34]，2005Ⅱ型聚酮合成酶基因1King等[35]，2009抗癌物ET-743基因1Rath等[36]，2011阿普拉毒素 1Grindberg等[37]，2011異氰化物1Brady等[38]，2005靛紅、靛藍(lán)1Lim等[39]，2005低溫脂肪酶1Jeon等[40]，2009耐鹽纖維素酶1Voget等[41]，2006多酚氧化酶1Beloqui等[42]，2006羧酸酯酶1Rashamuse等[43]，2009雙加氧酶1Suenaga等[44]，2007

5展望

運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)，有可能挖掘和利用99%以上的不可培養(yǎng)微生物，這些微生物蘊(yùn)藏著巨大的基因多樣性，提供了豐富的研究資源。雖然采用宏基因組技術(shù)獲得的活性物質(zhì)目前并不是很多，但它改變了我們解決很多問題的思路，豐富和拓展了對微生物世界多樣性的認(rèn)識，加速了新基因的發(fā)現(xiàn)。隨著未來研究手段的不斷進(jìn)步，細(xì)菌遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)、合成生物學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)等學(xué)科和領(lǐng)域的發(fā)展，必將使我們能從各類環(huán)境基因組文庫中獲得更多具有高價值的新酶、抗生素和其他活性產(chǎn)物，宏基因組學(xué)技術(shù)也必將發(fā)揮越來越大的作用，造福人類。

參考文獻(xiàn)：

[1]Torsvik V，Goksoyr J，Daae F L. High diversity in DNA of soil bacteria[J]. Applied and Environment Microbiology，1990，56（3）：782-787.

[2]Rappe M S，Giovannoni S J. The uncultured microbial majority[J]. Annual Review of Microbiology，2003，57：369-394.

[3]Handelsman J，Rondon M R，Brady S F，et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products[J]. Chemistry & Biology，1998，5（10）：245-249.

[4]Liles M R，Williamson L L，Rodbumrer J，et al. Recovery，purification，and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms[J]. Applied and Environment Microbiology，2008，74（10）：3302-3305.

[5]鈕旭光，韓梅，韓曉日. 宏基因組學(xué)：土壤微生物研究的新策略[J]. 微生物學(xué)通報，2007，34（3）：576-579.

[6]Gillespie D E，Brady S F，Bettermann A D，et al. Isolation of antibiotics turbomycin A and B from a metagenomic library of soil microbial DNA[J]. Applied and Environment Microbiology，2002，68（9）：4301-4306.

[7]Lmmle K，Zipper H，Breuer M，et al. Identification of novel enzymes with different hydrolytic activities by metagenome expression cloning[J]. Journal of Biotechnology，2007，127（4）：575-592.

[8]Beja O. To BAC or not to BAC：Marine ecogenomics[J]. Current Opinion in Biotechnology，2004，15（3）：187-190.

[9]Martín J F. Phosphate control of the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites is mediated by the PhoR-PhoP system：an unfinished story[J]. Journal of Bacteriology，2004，186（16）：5197-5201.

[10]Daniel R. The soil metagenome—a rich resource for the discovery of novel natural products[J]. Current Opinion in Biotechnology，2004，15（3）：199-204.

[11]Knietsch A，Bowien S，Whited G，et al. Identification and characterization of coenzyme B12-dependent glycerol dehydratase- and diol dehydratase-encoding genes from metagenomic DNA libraries derived from enrichment cultures[J]. Applied and Environment Microbiology，2003，69（6）：3048-3060.

[12]Schirmer A，Gadkari R，Reeves C D，et al. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta[J]. Applied and Environment Microbiology，2005，71（8）：4840-4849.

[13]Fieseler L，Hentschel U，Grozdanov L，et al. Widespread occurrence and genomic context of unusually small polyketide synthase genes in microbial consortia associated with marine sponges[J]. Applied and Environment Microbiology，2007，73（7）：2144-2155.

[14]Kim T K，F(xiàn)uerst J A. Diversity of polyketide synthase genes from bacteria associated with the marine sponge Pseudoceratina clavata：culture-dependent and culture-independent approaches[J]. Environmental Microbiology，2006，8（8）：1460-1470.

[15]Courtois S，Cappellano C M，Ball M，et al. Recombinant environmental libraries provide access to microbial diversity for drug discovery from natural products[J]. Applied and Environment Microbiology，2003，69（1）：49-55.

[16]Gupta R，Beg Q K，Lorenz P. Bacterial alkaline proteases：molecular approaches and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59（1）：15-32.

[17]Huang Y，Lai X，He X，et al. Characterization of a deep-sea sediment metagenomic clone that produces water-soluble melanin in Escherichia coli[J]. Marine Biotechnology，2009，11（1）：124-131.

[18]賀紀(jì)正，張麗梅，沈菊培，等. 宏基因組學(xué)（Metagenomics）的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2008，28（2）：209-218.

[19]Hu X P，Heath C，Taylor M P，et al. A novel，extremely alkaliphilic and cold-active esterase from Antarctic desert soil[J]. Extremophiles，2012，16（1）：79-86.

[20]Neveu J，Regeard C，DuBow M S. Isolation and characterization of two serine proteases from metagenomic libraries of the gobi and death valley deserts[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91（3）：635-644.

[21]Craig J W，Chang F Y，Brady S F. Natural products from environmental DNA hosted in Ralstonia metallidurans[J]. ACS Chemical Biology，2009，4（1）：23-28.

[22]Urbach E，Vergin K L，Giovannoni S J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria[J]. Applied and Environment Microbiology，1999，65（3）：1207-1213.

[23]Borneman J. Culture-independent identification of microorganisms that respond to specified stimuli[J]. Applied and Environment Microbiology，1999，65（8）：3398-3400.

[24]Cowan D，Meyer Q，Stafford W，et al. Metagenomic gene discovery：past，present and future[J]. Trends in Biotechnology，2005，23（6）：321-329.

[25]Wang K，Li G，Yu S Q，et al. A novel metagenome-derived beta-galactosidase：gene cloning，overexpression，purification and characterization[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88（1）：155-165.

[26]Yao J，F(xiàn)an X J，Lu Y，et al. Isolation and characterization of a novel tannase from a metagenomic library[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（8）：3812-3818.

[27]Liu Y，Lei Y，Zhang X，et al. Identification and phylogenetic characterization of a new subfamily of α-amylase enzymes from marine microorganisms[J]. Marine Biotechnology，2012，14（3）：253-260.

[28]Pang H，Zhang P，Duan C J，et al. Identification of cellulase genes from the metagenomes of compost soils and functional characterization of one novel endoglucanase[J]. Current Microbiology，2009，58（4）：404-408.

[29]Schipper C，Hornung C，Bijtenhoorn P，et al. Metagenome-derived clones encoding two novel lactonase family proteins involved in biofilm inhibition in Pseudomonas aeruginosa[J]. Applied and Environment Microbiology，2009，75（1）：224-233.

[30]Simon C，Herath J，Rockstroh S，et al. Rapid identification of genes encoding DNA polymerases by function-based screening of metagenomic libraries derived from glacial ice[J]. Applied and Environment Microbiology，2009，75（9）：2964-2968.

[31]De la Iglesia R，Valenzuela-Heredia D，Pavissich J P，et al. Novel polymerase chain reaction primers for the specific detection of bacterial copper P-type ATPases gene sequences in environmental isolates and metagenomic DNA[J]. Letters in Applied Microbiology，2010，50（6）：552-562.

[32]Banik J J，Brady S F. Cloning and characterization of new glycopeptide gene clusters found in an environmental DNA megalibrary[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（45）：17273-17277.

[33]Sivonen K，Leikoski N，F(xiàn)ewer D P，et al. Cyanobactins-ribosomal cyclic peptides produced by cyanobacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86（5）：1213-1225.

[34]Long P F，Dunlap W C，Battershill C N，et al. Shotgun cloning and heterologous expression of the patellamide gene cluster as a strategy to achieving sustained metabolite production[J]. Chembiochem，2005，6（10）：1760-1765.

[35]King R W，Bauer J D，Brady S F. An environmental DNA-derived type Ⅱ polyketide biosynthetic pathway encodes the biosynthesis of the pentacyclic polyketide erdacin[J]. Angewandte Chemie，2009，48（34）：6257-6261.

[36]Rath C M，Janto B，Earl J，et al. Meta-omic characterization of the Marine invertebrate microbial consortium that produces the chemotherapeutic natural product ET-743[J]. ACS Chemical Biology，2011，6（11）：1244-1256.

[37]Grindberg R V，Ishoey T，Brinza D，et al. Single cell genome amplification accelerates identification of the apratoxin biosynthetic pathway from a complex microbial assemblage[J]. PLoS One，2011，6（4）：e18565.

[38]Brady S F，Clardy J. Cloning and heterologous expression of isocyanide biosynthetic genes from environmental DNA[J]. Angewandte Chemie，2005，44（43）：7063-7065.

[39]Lim H K，Chung E J，Kim J C，et al. Characterization of a forest soil metagenome clone that confers indirubin and indigo production on Escherichia coli[J]. Applied and Environment Microbiology，2005，71（12）：7768-7777.

[40]Jeon J H，Kim J T，Kim Y J，et al. Cloning and characterization of a new cold-active lipase from a deep-sea sediment metagenome[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81（5）：865-874.

[41]Voget S，Steele H L，Streit W R. Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase[J]. Journal of Biotechnology，2006，126（1）：26-36.

[42]Beloqui A，Pita M，Polaina J，et al. Novel polyphenol oxidase mined from a metagenome expression library of bovine rumen：biochemical properties，structural analysis，and phylogenetic relationships[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281（32）：22933-22942.

[43]Rashamuse K，Magomani V，Ronneburg T，et al. A novel family Ⅷ carboxylesterase derived from a leachate metagenome library exhibits promiscuous beta-lactamase activity on nitrocefin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83（3）：491-500.

[44]Suenaga H，Ohnuki T，Miyazaki K. Functional screening of a metagenomic library for genes involved in microbial degradation of aromatic compounds[J]. Environmental Microbiology，2007，9（9）：2289-2297.劉瑞顯，李國鋒，徐立華，等. 棉花生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新系統(tǒng)的耗散結(jié)構(gòu)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：8-10.