應用宏基因組技術從微生物中獲得活性物質的研究進展

摘要：采用傳統培養的篩選方法，地球上99%以上的微生物還沒能被人類開發生產活性物質，這使得自然界中微生物資源的開發利用受到極大限制。宏基因組文庫技術的應用避開了微生物純培養的問題，極大拓展了微生物資源的利用空間，目前被廣泛應用于各種新的酶及活性物質的研究。在重點介紹宏基因組文庫的構建及篩選方法等，以及宏基因組技術在微生物活性物質篩選中應用的基礎上，對宏基因組研究存在的問題進行了探討。

關鍵詞：宏基因組文庫；微生物；活性物質；篩選

中圖分類號： Q789文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0005-03

收稿日期：2013-05-24

作者簡介：高岳（1979—），男，江蘇蘇州人，博士，講師，從事生物工程及微生物天然產物研究。Tel：（0512）66098727；E-mail：gaoyue0605@163.com。環境當中有超過99%的微生物不能進行人工培養，大多數微生物還沒能被人類用來開發生產可能的有用產物[1-2]。用傳統的微生物學方法沒有辦法對不可培養微生物的酶及其產物進行分析鑒定，但是，通過“宏基因組學”研究方法，可以直接從環境樣品中提取微生物DNA，讓微生物DNA在易培養宿主中克隆表達[3]。從自然界微生物群落中直接提取DNA后建立宏基因組文庫，然后進行克隆篩選，目前被廣泛應用于各種新的酶及活性物質的研究。

1宏基因組學的概念

1998年，Handelsman等首次提出了宏基因組（metagenome）的概念，是指特定環境中全部微生物基因的總和。宏基因組學（metagenomics）是一種新的微生物研究方法，它以環境樣品中微生物群體基因組為研究對象，通過基因篩選和序列分析等手段，來研究環境微生物的功能活性、多樣性、種群結構、進化關系，以及它們與環境之間的關系。宏基因組文庫包含了可培養和不可培養微生物基因的總和，不需要使用傳統的微生物純培養技術，極大地拓寬了微生物資源的利用空間，為獲得新的酶及生物活性物質提供了更廣闊的平臺。

2宏基因組文庫的構建

2.1DNA提取

DNA提取方法主要有2種：一種是直接（原位）裂解法，直接裂解環境樣品中的微生物細胞進行DNA抽提。這種方法操作簡單、成本較低、DNA獲得率比較高，也更具有代表性；但提出的DNA片段較小（1～50 kb），且用這種方法容易殘留環境樣品中的雜質，如腐殖酸、棕黃酸等，這些雜質對后續的PCR擴增等操作會產生強烈的影響。另一種是間接（異位）裂解法，即先采用差速離心等物理手段，將微生物細胞從環境樣品中分離出來，再用較溫和的方法來對DNA進行抽提。這種方法的優點是可以獲得大片段DNA（20～500 kb），而且純度高、雜質殘留少；但這種方法操作繁瑣，成本較高，DNA 獲得率比較低，且用此法抽提到的DNA主要來自于和土壤顆粒附著力較弱的微生物個體。因此，要根據研究手段及目的基因的大小，選擇合適的提取方法。Liles等證明了用甲酰胺高鹽溶液處理的樣品能夠提取大片段DNA，并能有效地提高宏基因組文庫的構建效率，這為獲取完整的大片段DNA提供了可借鑒的方法[4]。

2.2文庫構建

從環境樣品中提取DNA，用于構建宏基因組文庫，進而篩選各種活性物質。在構建文庫時，應根據自身的研究目的和獲得的DNA的量、純度、片段大小等來選擇載體和宿主。

載體的選擇需要考慮載體的大小、載體拷貝數、插入片段的大小、所用宿主及篩選方法等因素[5]。常用的克隆載體包括質粒（plasmid，插入片段10 kb以下）、黏粒（cosmid，插入片段40 kb左右）和細菌人工染色體（BAC，插入片段可達 350 kb）等，可滿足不同的插入片段大小要求。BAC 載體可以克隆大片段的DNA，增加了獲得完整的指導大分子活性物質合成途徑的編碼基因或基因簇的機會，在宏基因組克隆表達中具有一定的優勢。Gillespie等用細菌人工染色體載體pBeloBACⅡ構建了2個土壤樣品的宏基因組BAC文庫，獲得了2 個具有廣譜抗菌作用的新抗生素turbomycin A和 turbomycin B 及其合成酶基因簇[6]。

宿主菌株的選擇主要考慮轉化效率、重組載體在宿主細胞中的穩定性、外源基因的表達、目標性狀篩選等因素[5]。研究結果表明，不同微生物種類所產生的活性物質類型有明顯差異，因此，可根據不同研究目標選擇不同的宿主菌株，如70%的抗生素來源于放線菌，若尋找抗菌、抗腫瘤活性物質，應選擇鏈霉菌為宿主菌，而大腸桿菌則主要用于新型酶的篩選等[7]。大腸桿菌作為成熟的基因克隆表達受體細胞，仍然是研究宏基因組的首選宿主菌，如紫色桿菌素（violacein）C等在大腸桿菌中的成功表達[8]。鏈霉菌屬編碼次生代謝產物合成的基因以基因簇的形式存在，表達受到細胞信號交流和信號轉導的調控，具備天然抗生素產生機制[9]。

3活性物質文庫的篩選

采用傳統方法進行生物活性物質篩選時，一般都是獲得相應的混合物，然后還需要進行活性化合物分離、提純和鑒定等一系列后續處理。高品質的活性物質分析需要培養或發酵，產生某種活性物質的細菌，在發酵時其合成能力可能會降低，甚至喪失。應用宏基因組技術進行篩選時，由于合成該物質的基因攜帶在一定載體上，其功能基本不會丟失。活性物質文庫篩選是細菌之間通用某些功能基因及其表達調控子，克服了發酵限制，優越于傳統篩選。基于環境宏基因組的高度復雜性，必須有高通量、高靈敏度的方法來篩選和鑒定文庫中的目標基因或活性分子。應用宏基因組技術篩選活性物質時，根據目的不同，可從以下不同水平設計不同的篩選方案。

3.1序列驅動篩選

序列驅動篩選是指根據已知的基因或基因表達產物的保守序列設計探針或PCR引物，通過核酸雜交或PCR擴增，篩選具有目標序列的克隆子，以獲得某一類結構或功能類似的蛋白質新分子或其編碼基因[10-11]。來自海綿具有藥用價值的天然產物大多數是復雜的聚酮類化合物，海綿宏基因組編碼許多指導不同途徑的聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）[12-13]。PKS包括1個或多個模塊，每個模塊都至少包括3個結構域：酮體合成酶（ketosynthase，KS）、酰基轉移酶（acyl transferase，AT）、酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP），其中，KS編碼區同源性最高，因此，可以根據KS結構域的保守序列設計PCR引物[12-14]，從海綿宏基因組文庫中篩選攜帶PKS基因的克隆。Courtoi等構建了1個可以在大腸桿菌和鏈霉菌間轉移的穿梭Cosmid載體，并以此構建了1個土壤宏基因組文庫，通過序列驅動篩選獲得了新的抗腫瘤活性物質聚酮的合成酶基因簇[15]。序列篩選法的優點是不必依賴外源基因在宿主中的表達，但它無法篩選宏基因組文庫中那些和現有基因序列完全不同的新基因，因此較難發現新的活性物質。不過，Gupta等認為，當宏基因組文庫基因的保守序列與數據庫中已知基因的保守序列相似度低于40%時，基于序列的篩選策略也可能篩選到新的功能產物[16]。

3.2功能驅動篩選

功能驅動篩選主要通過化學等手段，從宏基因組文庫中檢測表達目標活性物質的克隆子，這種方法具有較高靈敏度，產色素的陽性克隆在平板上呈現的顏色不同，可以被快速篩選出來，如Huang等從構建的中國南海深海沉積物Fosmid宏基因組文庫中篩選到了產黑色素（melanin）的克隆[17]；或是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條件下功能互補生長的特性進行篩選[18]。Hu等在1個南極荒漠土壤宏基因組文庫中，使用含有底物甘油三酸酯三丁酸甘油酯的瓊脂平板篩選到1種新的酯酶[19]。Neveu等從戈壁和死亡谷沙漠宏基因組文庫中，在用脫脂牛奶作為底物的平板上分離到2個絲氨酸蛋白酶[20]。這種方法的優點是能找到各種新的酶及活性物質，但它受限于基因必須能在宿主中表達，表達產物能夠正常溶解，并且產生的蛋白質要能夠正確地折疊。然而，很多克隆的外源基因并不能在新的遺傳背景中實現表達。

3.3功能篩選法的改進

宏基因組文庫在進行功能篩選時，存在諸多問題，需要對宿主及載體系統進行改造及完善，改進表達系統，從而解決宏基因組基因在多宿主系統中的表達問題，如：可采用穿梭載體，使其在不同宿主中進行目的基因的表達，或是對大腸桿菌進行改造，擴大它對基因的表達范圍。目前，宏基因組文庫的構建常采用的表達系統是大腸桿菌和鏈霉菌，可以通過綜合考慮宿主的天然生物合成能力和它對外源啟動子的傾向性，拓展新的宿主菌用于宏基因組的研究。Craig等以R. metallidurans為克隆宿主，成功獲得了土壤eDNA 的編碼產物，其中有2個是新天然產物，他們還進一步驗證了獲得的產物在大腸桿菌中不能表達或無法被檢測到表達，進而證明了Ralstonia metallidurans可以作為宏基因組學文庫新的模式系統，用于發現新產物[21]。另外，還可結合其他相關技術來改進功能篩選法，如在克隆前運用超速離心法、密度梯度離心法、穩定同位素示蹤技術等[22-23]，對樣品中感興趣的基因或基因組進行富集，從而提高陽性克隆的比例。將親和篩選技術和噬菌體表面展示表達產物結合起來分離DNA，是一個高效易控制的高通量篩選方法，在宏基因組文庫中即使是稀少的DNA序列也可得到富集，有利于文庫中稀有DNA序列的表達[24]。

4部分微生物活性物質篩選情況

利用宏基因組技術篩選活性物質被證實是一種行之有效的方法，其效率遠遠超過其他方法并且具有廣闊的前景，是基因工程研究的一個主要方向。目前，研究人員已經利用功能和序列為基礎的方法通過宏基因組篩選，鑒定了比較多的新型酶及抗菌活性物質（表1），潛在的工業開發利用價值很大。

表1宏基因組文庫篩選的活性物質

活性物質1文獻β-半乳糖苷酶1Wang等[25] ，2010鞣酸酶1Yao等[26]，2011α-淀粉酶1Liu等[27]，2012內切葡聚糖酶1Pang等[28]，2009內酯酶1Schipper等[29] ，2009DNA聚合酶1Simon等[30]，2009ATP酶1de la Iglesia等[31]，2010糖肽基因1Banik 等[32]，2008核糖體環肽1Sivonen等[33]，2010抗癌物patellamide基因1Long等[34]，2005Ⅱ型聚酮合成酶基因1King等[35]，2009抗癌物ET-743基因1Rath等[36]，2011阿普拉毒素 1Grindberg等[37]，2011異氰化物1Brady等[38]，2005靛紅、靛藍1Lim等[39]，2005低溫脂肪酶1Jeon等[40]，2009耐鹽纖維素酶1Voget等[41]，2006多酚氧化酶1Beloqui等[42]，2006羧酸酯酶1Rashamuse等[43]，2009雙加氧酶1Suenaga等[44]，2007

5展望

運用宏基因組學技術，有可能挖掘和利用99%以上的不可培養微生物，這些微生物蘊藏著巨大的基因多樣性，提供了豐富的研究資源。雖然采用宏基因組技術獲得的活性物質目前并不是很多，但它改變了我們解決很多問題的思路，豐富和拓展了對微生物世界多樣性的認識，加速了新基因的發現。隨著未來研究手段的不斷進步，細菌遺傳學、分子生物學、基因組學、生物信息學、合成生物學和天然產物化學等學科和領域的發展，必將使我們能從各類環境基因組文庫中獲得更多具有高價值的新酶、抗生素和其他活性產物，宏基因組學技術也必將發揮越來越大的作用，造福人類。

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