MAPK調節水稻幼苗根系生長的分子機制

高華健+任靜+蔡鳳香+李偉+李晶+隋亞平+趙鳳云

摘要：以水稻品種中花 11 號為材料，利用 MAPKK 抑制劑 PD（PD 98059）分析了 MAPK 信號對水稻根系生長、H2O2 產生、生長素積累分布及生長素和細胞周期基因表達譜的影響。結果表明，PD 處理促進了初生根和不定根的伸長生長，但抑制了側根的形成和發育，并誘導了H2O2 的產生和生長素的積累增加。分子水平分析顯示，PD 處理分別使 14 個生長素基因和12 個細胞周期基因表達上調，使 3 個生長素基因和 7 個細胞周期基因表達下調。這些結果說明在正常條件下，MAPK 對水稻幼苗根系生長的調節與其控制 H2O2 產生和生長素平衡及調控生長素和細胞周期基因表達有密切關系。

關鍵詞：MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）；生長素；水稻根系

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0018-04

收稿日期：2013-04-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：30671126）；山東省淄博市科技發展計劃（編號：109036、111089）。

作者簡介：高華健（1992—），男，山東日照人，本科生；任靜（1990—），女，山東鄒平人，碩士研究生，從事植物逆境分子生物學研究。他們對本工作的貢獻相同。

通信作者：趙鳳云，教授，從事植物逆境分子生物學研究。E-mail：zfy1226@126.com。MAPK 信號級聯是植物體內的重要信號分子[1]，越來越多的證據表明 MAPK 信號在調節植物生長發育、細胞增殖、激素生理及環境脅迫應答過程中發揮重要作用[2]。生長素是植物體內的關鍵激素之一，影響植物根系生長、細胞分裂及基因表達。關于生長素與 MAPK 的關系有不同的報道[3-4]，如 Mockaitis等報道生長素誘導擬南芥根系 MAPK 活性增加[5]，Mizoguchi 等試驗也得到類似結果[6]。相反，Kovtun 等研究表明 NPK1（a specific plant MAPK kinase kinase，MAPKKK）激活 MAPK 信號級聯，抑制早期生長素應答基因轉錄[7]，Lee 等和 Dai 等分別報道 MPK12 和 MKK7 是生長素信號的負調控因子[8-9]。這些研究表明在生長素信號傳導過程中存在正調控和負調控 MAPK 途徑[4]。

細胞周期是控制植物生長的關鍵因子之一。MAPK 在細胞分裂過程中起核心作用[4]。如煙草NTF6（Nicotiana tabacum MAPK homolog）在細胞分裂晚后期被激活并瞬時定位在成膜體[10]。NTF4（N. tabacum MAPK homolog）在細胞周期的G1期表達低，但在S、G2期表達高[4]。Ma等報道在胞質分裂過程中MAPK磷酸化與細胞板形成有關[11]。細胞周期進程受細胞周期蛋白和（Cycs）和依賴于周期蛋白激酶（CDKs）等一系列蛋白調控[12]。ROS是植物體內的重要信號分子，有研究表明，MAPK信號途徑不僅受ROS誘導，還調節ROS產生[13-14]。這些結果顯示MAPK與生長素、細胞周期和 ROS 有密切關系，我們的前期研究發現生長素、細胞周期和 ROS 都參與了水稻根系生長的調節[15]，但是在水稻幼苗根系生長發育過程中 MAPK 與它們的關系還不清楚。本試驗以水稻品種中花11號為材料，利用 MAPKK 抑制劑 PD（PD 98059）研究 MAPK 信號對水稻根系生長、H2O2 產生、生長素積累分布及生長素和細胞周期基因表達譜的影響。1材料與方法

1.1材料與處理

以水稻中花 11 號為材料，挑選籽粒飽滿的種子去殼后消毒：75% 乙醇（30 s）、0.1% 氯化汞（15 min）、2% 次氯酸鈉（20 min），無菌水沖洗 6 次以上，然后將種子分別種在MS 培養基上，置于培養箱內[光周期為 14 h光照，光照強度為 200 μmol/（m2·s），白天溫度 26 ℃，夜間10 h溫度為20 ℃，空氣相對濕度為 50%～60%]培養8 d，然后轉入Hoagland營養液添加15 μmol/L PD（PD 98059，MAPKK 抑制劑）處理 5 d，每種處理至少重復3次，每次3個平行試驗，每個試驗 50～60 株。

1.2根系生長統計

初生根和不定根的長度用尺子測量，初生根和不定根上側根的數量和長度用帶數碼相機的顯微鏡統計和測量，每個指標統計60株。

1. 3H2O2 含量的測定

H2O2的定性和定量測定分別參照Chen等[16]及Loreto等[17]方法進行，每種處理至少用20株。

1.4生長素分布和積累的測定

利用轉DR5-GUS 基因水稻對生長素的分布和積累進行測定，方法參照Petersson 等[18]。轉基因水稻種子在MS 培養基萌發生長8 d，然后轉入Hoagland營養液添加15 μmol/L PD在上述同樣條件下分別處理5、10 h，或在Hoagland營養液同時添加0.06% H2O2 和15 mmol/L DMTU（H2O2 清除劑）處理5 h，每種處理至少用20株進行GUS 活性檢測。

1.5RT-PCR 分析

使用 Trizol 試劑提取總 mRNA，取1 μg 總 mRNA，利用RNA PCR Kit（AMV）V3.0合成cDNA。每個處理PCR反應用等量的 cDNA，每個泳道用25 μL PCR 產物，每個PCR反應在同樣條件下獨立重復3次。Osactin1 基因作為內標，通過Gel-Pro Analyzer 軟件對基因轉錄活性進行半定量，將對照的轉錄水平設置為1，基因表達水平≥1.3為表達上調，≤0.7為表達下調。

1. 6數據處理

用Excel進行原始數據的處理。取3次重復試驗的平均值。用單因子方差分析PD處理與對照之間的差異，P<0.05 表示差異顯著。

2結果與分析

2.1MAPK對水稻幼苗根系生長的影響

由圖1-A，B可見，與對照相比，PD處理促進了初生根和不定根的伸長生長（P<0.05）。相反，該處理條件下側根的形成和生長受到抑制（P<0.05）（圖1-C、D）。說明在正常條件下MAPK 對水稻根系特別是側根的生長和發育起重要的調節作用。

2.2MAPK對水稻幼苗根系H2O2含量的影響

MAPK對H2O2的產生有調節作用。為了進一步了解MAPK對根系生長的調節是否與H2O2產生有關，定性和定量測定了根系中H2O2的產生。結果顯示，在PD處理條件下，H2O2的含量比對照組的增加（P<0.05）（圖2-A），定性測定結果與定量測定結果一致（圖2-B）。

2.3MAPK對水稻根系生長素積累和分布的影響

生長素是調節根系生長的重要信號分子之一，為了解MAPK調節水稻根系的生長是否與生長素有關，本試驗利用轉DR5-GUS 基因水稻對PD處理中根系生長素的分布和積累進行了測定（圖3）。與對照比，PD處理5 h 和10 h使生長素在初生根根尖各區的積累都明顯增加。H2O2 處理5 h 生長素在初生根根尖各區的積累也明顯增加，但用H2O2 及其清除劑DMTU 同時處理5 h 后，生長素在成熟區和伸長區的積累減少。這3種處理條件下生長素在不定根根尖各區的積累與分布與初生根的類似。

2.4MAPK對水稻根系生長素基因表達譜的影響

為進一步了解MAPK 與生長素信號的關系，利用RT-PCR 和半定量技術分析了生長素信號途徑上的關鍵基因家族包括OsPINs（生長素運輸）、OsARFs、OsIAAs（生長素應答）

表達的變化。圖4顯示，在PD 處理條件下有17個生長素基因的表達水平發生了明顯變化，在這17個基因中只有3個基因（即OsPIN5a、OsPIN9、OsIAA13）的表達下調，其他14個基因（包括OsPIN1b、OsPIN5b、OsARF1、OsIAA2、OsIAA30 等）的表達水平都明顯升高，說明在正常條件下前3個基因受MAPK 信號級聯正調控，而后14個基因受MAPK 信號級聯負調控。PD 處理誘導生長素積累的變化可能與其調節生長素基因表達有密切關系。

2.5MAPK對水稻根系細胞周期基因表達譜的影響

細胞分裂是控制根系生長的重要因素之一，MAPK和生長素都對細胞周期基因表達有調節作用，試驗進一步分析了MAPK對細胞周期基因表達的影響。由圖5可見，PD 處理使7個細胞周期基因（包括Orysa；CycB2；2、Oryza；CycU2；1、Oryza；CDKC；3、Orysa；CDKE；1、Orysa；CDKG；1、Orysa；CDKG；2、Orysa；CKL2）表達下調，12個基因（包括Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB2；1、Orysa；CycD5；1、Oryza；CDKC；1、Oryza；KRP5、Orysa；RB2 等）表達水平上調，說明正常條件下前7個基因受MAPK 信號級聯正調控，而后12個基因受MAPK 信號級聯負調控。PD 處理誘導根系生長的變化可能與其調節細胞周期基因表達有關。

3討論

MAPK 信號在調節植物生長發育、細胞增殖、激素生理過程中發揮重要作用[2]。PD 處理抑制 IAA和 ON 誘導的黃瓜不定根形成[19]。本試驗結果顯示，PD 處理促進了初生根和

不定根的伸長生長，但是抑制了側根的形成與發育（圖1）。生長素影響植物根系生長發育，OsPINs、OsARFs、OsIAAs是生長素信號途徑上的關鍵基因家族[20-22]。研究表明在生長素信號傳導過程中存在正調控和負調控 MAPK 信號途徑[3-9]。 本試驗中，PD 處理使生長素在根尖的積累增加（圖3），分子水平分析顯示該條件下多數生長素基因表達上調，說明 MAPK 信號途徑負調控生長素信號，但是，有 3 個生長素基因的表達下調（圖4），暗示 MAPK 信號途徑也正調控生長素信號，這可能是因為 MAPK 信號級聯不同成員的結合可以調控不同基因的表達。因此 MAPK 與生長素的關系復雜，既有正調控途徑也有負調控途徑。PD 對根系生長的調節可能與其誘導生長素的增加和調控生長素基因表達有關。試驗結果還說明，在正常條件下 MAPK 可能通過調節生長素基因表達控制生長素平衡。

MAPK 在細胞分裂過程中起核心作用[4，6，10-11]。細胞周期進程受細胞周期蛋白等一系列蛋白調控[12]。MAPK 正調控細胞分裂相關基因表達[23]。但是本研究顯示，在水稻根系生長發育過程中 MAPK 對細胞周期基因表達的調節既有正調控（如Oryza；CDKC；3 和Orysa；CDKG；2 等）也有負調控（如Orysa；CycA2；1 和Oryza；KRP5等）（圖5），PD 對根系生長的調節可能與其調控細胞周期基因表達有關。我們的前期研究表明，ROS 是調節水稻根系生長發育及生長素和細胞周期基因表達的重要信號分子[15]，MAPK 信號調節 ROS 產生[14]，大豆 GmMPK4 基因沉默導致 H2O2 積累增加[23]。本研究中 PD 處理誘導 H2O2 增加（圖2），而且 PD 誘導生長素積累的變化與 H2O2 處理的類似（圖3），這些結果暗示 MAPK 對根系生長的調節可能還與 H2O2 有關。另外，本試驗條件下，只有部分生長素（17個）和細胞周期（19個）基因的表達受 MAPK 信號級聯調控，其余基因的表達無明顯變化，說明在調節水稻根系生長過程中還存在其他信號途徑，如 ROS 信號途徑[15]。綜上所述，MAPK 信號級聯可能通過調節 H2O2 產生和生長素平衡及細胞周期基因的表達參與了水稻根系生長的調控（圖6）。

參考文獻：

[1]Xiong L，Yang Y. Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice

are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase[J]. Plant Cell，2003，15（3）：745-759.

[2]Nakagami H，Pitzschke A，Hirt H. Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling[J]. Trends in Plant Sci，2005，10（7）：339-346.

[3]Jonak C，Okrész L，Bgre L，et al. Complexity，cross talk and integration of plant MAP kinase signalling[J]. Current Opinion in Plant Biology，2002，5（5）：415-424.

[4]Mishra N S，Tuteja R，Tuteja N. Signaling through MAP kinase networks in plants[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2006，452（1）：55-68.

[5]Mockaitis K，Howell S H. Auxin induces mitogenic activated protein kinase（MAPK）activation in Roots of Arabidopsis seedlings[J]. Plant Journal，2000，24（6）：785-796.

[6]Mizoguchi T，Gotoh Y，Nishida E，et al. Characterization of two cDNAs that encode MAP kinase homologues in Arabidopsis thaliana and analysis of the possible role of auxin in activating such kinase activities in cultured cells[J]. Plant Journal，1994，5（1）：111-122.

[7]Kovtun Y，Chiu WL，Zeng W，et al. Suppression of auxin signal transduction by a MAPK cascade in higher plants[J]. Nature，1998，395（6703）：716-720.

[8]Lee J S，Wang S，Sritubtim S，et al. Arabidopsis mitogen-activated protein kinase MPK12 interacts with the MAPK phosphatase IBR5 and regulates auxin signaling[J]. Plant Journal，2009，57（6）：975-985.

[9]Dai Y，Wang H，Li B，et al. Increased expression of MAP KINASE KINASE7 causes deficiency in polar auxin transport and leads to plant architectural abnormality in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2006，18（2）：308-320.

[10]Calderini O，Bgre L，Vicente O，et al. A cell cycle regulated MAP kinase with a possible role in cytokinesis in tobacco cells[J]. Journal of Cell Science，1998，111（Pt 20）：3091-3100.

[11]Ma Z，Yu G. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase（MAPK）is required for cytokinesis and progression of cell cycle in tobacco BY-2 cells[J]. Journal of Plant Physiology，2010，167（3）：216-221.

[12]Guo J，Song J，Wang F，et al. Genome-wide identification and expression analysis of rice cell cycle genes[J]. Plant Molecular Biology，2007，64（4）：349-360.

[13]Nakagami H，Soukupová H，Schikora A，et al. A mitogen-activated protein kinase kinase kinase mediates reactive Oxygen species homeostasis in Arabidopsis[J]. The Journal of Biological Chemistry，2006，281（50）：38697-38704.

[14]Pitzschke A，Hirt H. Disentangling the complexity of mitogen-activated protein kinases and reactive Oxygen species signaling[J]. Plant Physiology，2009，149（2）：606-615.

[15]Zhao F Y，Han M M，Zhang S Y，et al. Hydrogen peroxide-mediated growth of the root system occurs via auxin signaling modification and variations in the expression of cell-cycle genes in rice seedlings exposed to Cadmium stress[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2012，54（12）：991-1006.

[16]Chen Z H，Feng T T，Liu L Y，et al. Effect of glucose on zinc-induced growth of root system in rice[J]. Agricultural Science and Technology，2011，12（9）：1334-1337.

[17]Loreto F，Velikova V. Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage，quenches ozone products，and reduces lipid peroxidation of cellular membranes[J]. Plant Physiology，2001，127（4）：1781-1787.

[18]Petersson S V，Johansson A I，Kowalczyk M，et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis[J]. Plant Cell，2009，21（6）：1659-1668.

[19]Pagnussat G C，Lanteri M L，Lombardo M C，et al. Nitric oxide mediates the indole acetic acid induction activation of a mitogen-activated protein kinase cascade involved in adventitious root development[J]. Plant Physiology，2004，135（1）：279-286.

[20]Wang D，Pei K，Fu Y，et al. Genome-wide analysis of the auxin response factors（ARF）gene family in rice （Oryza sativa L.）[J]. Gene，2007，394：13-24.

[21]Wang J R，Hu H，Wang G H，et al. Expression of PIN genes in rice（Oryza sativa L.）：tissue specificity and regulation by hormones[J]. Molecular Plant，2009，2（4）：823-831.

[22]Song Y，Wang L，Xiong L. Comprehensive expression profiling analysis of OsIAA gene family in developmental processes and in response to phytohormone and stress treatments[J]. Planta，2009，229（3）：577-591.

[23]Liu J Z，Horstman H D，Braun E，et al. Soybean homologs of MPK4 negatively regulate defense responses and positively regulate growth and development[J]. Plant Physiology，2011，157（3）：1363-1378.李旭艷，邵淑麗，張偉偉，等. 質粒介導的RNAi沉默 mdr1基因增強白血病耐藥細胞HT9對姜黃素的敏感性[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：22-25.