質粒介導的RNAi沉默 mdr1基因增強白血病耐藥細胞HT9對姜黃素的敏感性

李旭艷　邵淑麗　張偉偉　惲東澤　付博　張珍珠

摘要：通過pSilencer 2.1質粒介導的RNAi技術沉默急性早幼粒白血病耐藥HT9細胞的耐藥基因mdr1表達，可提高耐藥細胞對姜黃素的敏感性。通過設計合成靶向mdr1基因的shRNA干擾片段，定向克隆到pSilencer 2.1-U6 neo質粒中，成功構建沉默mdr1基因特異表達的shRNA表達載體，電轉染HT9細胞后篩選陽性克隆擴大培養(yǎng)。采用實時熒光定量PCR、Western blot檢測細胞mdr1基因表達情況，流式細胞術檢測P-糖蛋白外排泵功能，MTT法和流式細胞技術檢測細胞對藥物敏感性和細胞周期分布。結果顯示，構建的shRNA表達載體pU6/shRNA/mdr1轉染HT9細胞后，HT9/pU6/shRNA細胞mdr1 mRNA表達降低了78.84%（P<0.01），P-糖蛋白的表達量降低了48.27%（P<0.05），細胞內Rho123相對熒光強度由10.8%±058%升高至73.56%±1.37%；轉染細胞對姜黃素敏感性明顯增強，IC50由（24.10±0. 83） μmol/L降至（5.10±014） μmol/L；耐藥相對逆轉率為84.74%±1.86%，與HT9細胞相比，經姜黃素處理的穩(wěn)定轉染細胞HT9/pU6/shRNA細胞周期阻滯在S、G2/M期。說明質粒介導的shRNA表達載體pU6/shRNA/mdr1能夠穩(wěn)定、持久地抑制mdr1基因表達，能有效增強HT9細胞對姜黃素的敏感性。

關鍵詞：shRNA；pSilencer 2.1-U6 neo質粒；多藥耐藥性；HT9細胞；姜黃素

中圖分類號：R961文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0022-04

收稿日期：2013-06-06

基金項目：黑龍江省自然科學基金（編號：C200624）；黑龍江省教育廳科技項目（編號：11511447、12511611）。

作者簡介：李旭艷（1982—），女，山東陽谷人，碩士，講師，從事分子生物學研究。Tel：（0452）2742695；E-mail：lxy0702@126.com。

通信作者：邵淑麗，博士，教授，從事分子生物學研究。Tel：（0452）2738219；E-mail：shshl32@163.com。近年來，白血病的治愈率已有明顯提高，但由于白血病細胞中存在多種耐藥相關基因異常的高表達，致使白血病細胞對抗癌藥物產生耐藥性，導致部分白血病患者治療失敗或在化療后復發(fā)。研究表明，多藥耐藥基因mdr1的過表達成為經典的多藥耐藥表型[1-2]。mdr1基因的表達產物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）可以利用ATP水解釋放的能量將化療藥物泵出細胞外，使細胞內藥物濃度始終維持在低水平，使藥物的細胞毒作用減弱，從而導致細胞產生耐藥性[1]。P-糖蛋白對藥物的特異性很小，能夠運輸多種結構不同的底物，如長春新堿、蒽環(huán)類藥物（柔紅霉素、阿霉素）、姜黃素、紫杉醇等，因此耐藥細胞能對許多結構和作用機制不同的藥物產生耐性。目前，RNA干擾（RNA interference，RNAi） 已用于沉默腫瘤細胞耐藥基因表達，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[3-4]。本試驗以質粒pSilencer 2.1-U6 neo為基礎，成功構建了shRNA表達載體pU6/shRNA/mdr1，轉染早幼粒白血病耐藥HT9細胞，觀察細胞mdr1基因表達情況、蛋白功能及細胞對姜黃素敏感性的變化。

1材料與方法

1.1材料

pSilencer 2.1-U6 neo由北京鼎國生物技術有限責任公司惠贈，人急性早幼粒白血病細胞株HL60、耐三尖杉酯堿的HL60細胞株HT9由北京師范大學生命科學學院提供，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海生工生物工程技術服務有限公司，鼠抗人單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠二抗為北京中山金橋生物技術有限公司產品。ECM830型電穿孔儀（BTX）；熒光定量RCP儀（Bio-Rad）；流式細胞儀FC500（Beckman）；7700 Real-Time PCR 儀（ABI）。

1.2方法

1.2.1pU6/shRNA/mdr1載體的構建根據(jù)GenBank P-糖蛋白編碼基因mdr1 mRNA的已知序列（NM_000927），選擇1 個shRNA特異性靶位點序列，設計合成編碼shRNA的DNA模板序列：正義鏈GATCCGGAGGCCAACATACATGCCTTCAAGAGAGGCATGTATGTTGGCCTCCTTTTTTGGAAA；反義鏈AGCTTTTCCAAAAAAGGAGGCCAACATACATGCCTCTCTTGAAGGCATGTATGTTGGCCTCCG，退火形成雙鏈，將其定向克隆到 pSilencer2.1-U6 neo載體上，shRNA重組質粒命名為 pU6/shRNA/mdr1。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，測序驗證插入序列無突變。大量提取純化質粒，待轉染。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉染HT9細胞用含1.0 μg/mL三尖杉酯堿的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，試驗前2 周取出三尖杉酯堿培養(yǎng)細胞。取對數(shù)生長期的HT9細胞，利用線性化的 pEGFP-N1質粒優(yōu)化電轉染條件，線性化的pSilencer 2.1-U6 neo 空質粒、pU6/shRNA/mdr1重組質粒于最佳電轉染條件下轉染HT9細胞，轉染后的細胞為HT9/pU6（空載體對照轉染細胞）、HT9/pU6/shRNA（轉染重組質粒細胞），轉染后用 600 μg/mL G418篩選建立穩(wěn)定轉染的HT9細胞克隆，有限稀釋法挑取單克隆轉染細胞。試驗另設非耐藥對照細胞HL60，耐藥非轉染對照細胞HT9。

1.2.3Real-time PCR檢測mdr1 mRNA表達量采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取各組細胞總RNA，用Real-time PCR檢測以上細胞mdr1基因的表達量。反應體系為25 μL：上、下游引物各0.25 μL，SYBR Green Ⅰ 1 μL，ddH2O 18 μL，cDNA 0.5 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸。反應在ABI 7700 Real Time PCR儀上進行，以β-actin作為內參對照，引物序列具體情況見表1。表1引物序列與擴增片段長度

引物名稱1引物序列（5′→3′）1擴增片段長度（bp）mdr11F：ATATCAGCAGCCCACATCAT；R：GAAGCACTGGGATGTCCGGT1154β-actin1F：ATCATGTTTGAGACCTTCAACA；R：CATCTCTTGCTCGAAGTCCA1318

1.2.4P-糖蛋白表達量的Western blot檢測提取各組細胞總蛋白，測定樣品純度，再進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗人P-糖蛋白單克隆抗體C219（1 ∶40），室溫孵育1.5 h，PBS洗膜，HRP標記的山羊抗鼠二抗（1 ∶5 000），室溫孵育1.5 h，ECL發(fā)光液顯影、定影、洗片，用凝膠圖像分析軟件分析X光片灰度值。

1.2.5FCM檢測P-糖蛋白外排泵功能收集對數(shù)生長期各組細胞，分別與10 μg/mL Rho123混勻，37 ℃孵育 30 min，用預冷的PBS洗細胞，再重懸于預冷的PBS中，用流式細胞儀檢測細胞內Rho123熒光強度。

1.2.6MTT法檢測耐藥細胞對姜黃素敏感性收集對數(shù)生長期的各組細胞，按接種量1萬個/孔接種于96 孔中，常規(guī)條件下分別與8個濃度梯度的姜黃素培養(yǎng)48 h，每個濃度3個平行，采用常規(guī)四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）于570 nm下測定吸光度D，計算細胞存活率：細胞存活率=D試驗組/D對照組×100%，以藥物濃度為橫軸，細胞存活率為縱軸繪制濃度效應曲線，求出回歸方程，確定半數(shù)抑制濃度（IC50），并計算相對逆轉率：逆轉率=[IC50（A）-IC50（B）]/[IC50（A）-IC50（C）]×100%，IC50（A）、IC50（B）、IC50（C）分別代表逆轉前耐藥細胞、逆轉后耐藥細胞和親本敏感細胞的IC50。

1.2.7FCM檢測細胞周期取對數(shù)生長期各組細胞100萬個，接種100 mL 培養(yǎng)瓶內，分別加入終濃度為8.0 μmol/L姜黃素，培養(yǎng)48 h，800 r/min離心10 min收集細胞，與1 mL預冷的70%乙醇充分混勻，4 ℃保存，至少固定18 h，細胞濃度調整為100萬個/mL，洗滌，重懸于1 mL含 20 μg/mL RNase A和50 μg/mL PI的染液中，37 ℃孵育30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，進行單因素方差分析，組間差異性分析采用LSD法，數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”表示。

2結果與分析

2.1pU6/shRNA/mdr1重組載體對mdr1-mRNA表達的影響

熒光定量PCR結果（圖1）顯示，HT9/pU6/shRNA細胞的mRNA 相對表達量極顯著低于HT9 細胞、HT9/pU6細胞；與HT9 細胞相比，HT9/pU6/shRNA 細胞mdr1基因的相對表達量降低了78.84% （P<0.01）；HT9/pU6與HT9 細胞的mRNA 相對表達量差異不顯著（P>0.05）；HT9/pU6/shRN與HL60細胞mRNA 相對表達量差異顯著（P<0.05）。說明

重組質粒pU6/shRNA/mdr1對HT9 細胞目的基因mdr1的表達有一定的干擾作用，而空載體對目的基因表達無干擾作用。

2.2pU6/shRNA/mdr1重組載體對P-糖蛋白表達的影響

用Western blot檢測各組細胞內P-糖蛋白水平，以其與內參β-actin的比值表示蛋白相對表達量。結果（圖2）顯示，HT9/pU6/shRNA細胞的P-糖蛋白表達量比HT9細胞低48.27%（P<0.05），HT9/pU6細胞與HT9 細胞蛋白相對表達量差異不顯著（P>0.05），HT9/pU6/shRNA細胞與HL60細胞蛋白相對表達量差異顯著（P<0.05）。證實了重組質粒pU6/shRNA/mdr1對HT9 細胞mdr1基因沉默的有效性。

2.3pU6/shRNA/mdr1重組載體對P-糖蛋白外排泵功能的影響

經流式細胞術分析（表2）可知，與HT9細胞相比，HT9/pU6/shRNA 細胞的Rho123熒光強度極顯著增強（P<001），而HT9/pU6細胞內Rho123熒光強度變化不顯著（P>005）；HT9/pU6/shRNA細胞與 HL60細胞內熒光強度差異極顯著（P<0.01）。說明轉染后的單克隆細胞 HT9/pU6/shRNA 的P-糖蛋白外排泵功能極顯著增強。

2.4RNAi對HT9細胞的影響

HT9細胞的IC50與HL60細胞差異顯著，進一步說明HT9 細胞具有高度耐藥性。姜黃素藥物濃度與細胞存活率呈負相關關系，相同作用條件下，HT9/pU6/shRNA細胞存活率降低最明顯。與HT9 細胞相比，HT9/pU6/shRNA細胞對姜黃素的IC50極顯著降低（P<0.01），而HT9/pU6細胞對姜黃素的IC50降低但差異不顯著（P>0.05）；HT9/pU6/shRNA細胞對姜黃素的IC50與HL60細胞差異極顯著（P<001），干擾片段對耐藥細胞的耐藥相對逆轉率為（84.74±186）%（表3）。

2.5pU6/shRNA/mdr1重組載體對HT9細胞周期的影響

用流式細胞儀檢測經姜黃素作用48 h的各組細胞周期顯示，與HT9細胞相比，HT9/pU6/shRNA和HL60細胞周期

表2各組細胞內 Rho123的相對熒光強度情況

細胞1Rho123 相對應光強度（%）HT9110.80±0.58aAHT9/pU6110.44±0.45aAHT9/pU6/shRNA173.56±1.37bBHL60195.13±1.12cC注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫、大寫字母表示差異顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）（n=3）。下同。

發(fā)生了明顯變化，表現(xiàn)為S、G2/M期細胞增多，HT9/pU6細胞周期未發(fā)生明顯變化，說明轉染細胞HT9/pU6/shRNA和HL60細胞周期經姜黃素處理后阻滯在S、G2/M期（圖3）。

3結論與討論

白血病是最常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤之一，目前聯(lián)合化療仍然是白血病治療的重要措施，而白血病細胞多藥耐藥性的產生則使部分白血病的化療或預后最終失敗。研究表明，在經典的白血病多藥耐藥表型中，通過對P-糖蛋白的檢測可以判斷白血病病人對當前化療藥物是否具有抗性，以選擇恰當?shù)闹委煼桨浮Ｄ退幠孓D劑、免疫治療、基因治療等技術已被臨床應用于提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，輔助提高腫瘤治愈率。RNA干擾技術是近年來發(fā)展起來的一項特異性抑制基因表達的基因治療方法，這一特異、有效的基因沉默技術現(xiàn)已被廣泛應用于腫瘤多藥耐藥等方面的研究[5-6]。Yague等將設計的2對pSUPER-shRNA質粒表達載體轉染給白血病耐藥細胞K562/ADR后，對mdr1基因表達的抑制率達95%、97%，細胞對藥物的敏感性恢復至與K562細胞幾乎相同的水平[7]。Alexandra等應用H1啟動子介導的RNA干擾載體抑制胃癌EPG85-257RDB細胞mdr1基因表達，細胞耐藥逆轉率達74%[8]。

本試驗成功構建了RNA干擾pU6/shRNA/mdr1重組質粒，該重組質粒利用RNA聚合酶Ⅲ U6啟動子表達siRNA分子，有利于對靶基因表達受到抑制后細胞表型的長期變化進行觀察，該重組質粒轉染HT9細胞后，構建了長期有效的基因沉默細胞模型。經熒光定量PCR和Western檢測可知，與HT9細胞相比，單克隆細胞HT9/pU6/shRNA的 mdr1基因表達量降低了78.84%（P<0.01），P-糖蛋白表達量降低了48.27%（P<0.05），RNAi對mdr1基因的表達起到了一定的抑制作用。經流式細胞術檢測可知，轉染后的HT9細胞內熒光強度由10.8%±0.58%增強到73.5%±1.37%，因Rho123是多藥抗性細胞P-糖蛋白的底物，能被蛋白水解釋放的能量從細胞內泵出，HT9/pU6/shRNA細胞內Rho123熒光強度的增強反映該細胞藥物外排功能減弱。轉染后，HT9細胞經姜黃素處理的IC50由（24.10±0.83） μmol/L降至（510±0.14） μmol/L，耐藥相對逆轉率為（84.74±186）%，經姜黃素作用48 h后，細胞周期阻滯在S、G2/M期。姜黃素的抗癌機制還未完全清楚，目前已發(fā)現(xiàn)它通過延長細胞周期使細胞在S 期和（或）G2/M期集聚，達到抗增殖的作用[9-10]，在本試驗中已得到證實。

RNAi技術可通過雙鏈短RNA（double-stranded RNA，dsRNA）觸發(fā)同源性mRNA降解[11]，目前有2種方式可以獲得雙鏈短RNA。其一，體外合成siRNA分子后采用轉染、電轉化等方法將其導入細胞內發(fā)揮作用[12]；其二，利用表達載體或siRNA表達框轉染細胞，在體內合成所需要的siRNA分子。體外合成siRNA易被降解，并需專門的RNA轉染試劑轉染細胞，在細胞內的干擾效應持續(xù)時間短，利用質粒、病毒類載體介導的siRNA表達載體克服了以上缺點[13]，同時載體上的抗性標記有助于快速篩選出轉染的陽性單克隆細胞。目前，用于表達siRNA的啟動子有RNA聚合酶Ⅲ類啟動子（pol Ⅲ）及RNA聚合酶Ⅱ類啟動子（pol Ⅱ）。這些啟動子可以在體內高效轉錄小的、非編碼的、在5′端無帽狀結構、在3′端無多聚腺苷酸化的轉錄本，啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉錄合成RNA，遇到4～5個連續(xù)的U即終止，轉錄產物在第2個尿嘧啶處被切下來，非常精確，從而可以限制轉錄RNA的大小；另外，這類啟動子本身序列較短，不會形成復雜的空間結構。目前U6、H1啟動子介導的RNAi技術已在多種腫瘤耐藥細胞中應用[14-15]。綜上所述，利用質粒介導的RNAi可以有效抑制mdr1基因編碼蛋白的表達和功能，提高耐藥細胞對姜黃素的敏感性。本研究為白血病耐藥逆轉治療提供了理論基礎。

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