植物組織培養的污染防治

湯雪燕　趙統利　邵小斌　朱朋波　劉興滿　孫明偉　徐燕

摘要：植物組織中普遍存在內生菌，當植物組織進行離體培養時，這些內生菌就會產生污染。污染是植物組織培養中經常遇到的問題，且很難控制。本文論述了植物組織的污染防治方法，并討論了抗生素使用的效果、穩定性、注意事項以及對污染原因的判斷、污染苗搶救，以減少組織培養中的工作量，從而提高經濟效益。

關鍵詞：組織培養；污染；防治；殺菌劑

中圖分類號： Q945.52文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0050-02

收稿日期：2013-05-08

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（10）115、CX（13）3014]；江蘇省連云港市科技攻關項目（編號：CN1203）；江蘇省六大人才高峰項目。

作者簡介：湯雪燕（1983—），女，江蘇江陰人，碩士，助理研究員，主要從事植物營養及花卉研究與技術推廣工作。Tel：（0518）85803250；E-mail：3202txy@163.com。廣義上植物組織培養是在人工控制條件下，把植物體的單個器官、組織或細胞從植物體分離后置于適宜營養和環境下，使之繼續生長、分化并發育成完整再生植株的培養技術。近年來，植物組織培養作為一種生物技術已滲透到與之相關的農業、林業、醫藥等領域的多個學科，為這些學科的發展提供了研究手段與理論基礎，同時創造了豐厚的經濟效益。雖然組織培養的操作并不難，但對一些技術環節的要求卻十分嚴格，稍有疏忽便會延誤試驗進程，甚至導致整個試驗失敗。利用組織培養進行工廠化育苗時如發生污染，輕者影響繁殖計劃，影響當季生產，重者造成珍貴品種丟失，組織培養室體系癱瘓。本文分析了組織培養工作中的污染防治問題，以期減少組織培養中的工作量，從而提高經濟效益。

1植物組織培養中污染的來源

植物組織培養污染主要是由霉菌、細菌、酵母菌引起的污染。菌類傳播途徑有戶外風傳播、渦流傳播、接種傳播，不正確操作也會增加污染概率，如滅菌不夠、操作過慢，另外還有內生菌造成的潛伏性污染[1]。有些植物上昆蟲、螨蟲的體表帶有霉菌的孢子、細菌，在9—10月份是重要污染源，此時大量昆蟲造成的污染源最易造成組織培養污染的嚴重發生。

2植物組織培養中污染的防治

2.1細菌污染

2.1.1細菌污染定義細菌是處于生物和非生物之間的微生物。從形態上看，細菌可以分成球菌、桿菌、螺旋菌等3類。土壤、水、城市空氣里都有細菌散布，種類達50種以上[2]。

細菌污染是指在培養過程中，在培養基表面或材料表面出現黏液狀物體、菌落或渾濁水跡狀物質，有時甚至出現泡沫發酵狀物質。細菌污染又以芽孢桿菌污染最普遍、最嚴重，這種芽孢桿菌能耐一定高溫、高壓，對消毒劑和紫外線也有一定抗性，常由于高壓滅菌不徹底造成污染。細菌性污染主要是工作人員使用了未經充分消毒的工具如剪刀、鑷子、三角瓶等，或是由呼吸排出的細菌，有時操作人員用手接觸材料或器具邊緣，使微生物落入培養基中，有時也會因剪取帶菌材料后沒消毒，用具又未徹底滅菌，極易造成污染。另外，由于組織培養室面積大、易污染，室內溫度高，空氣濕度大，菌類繁殖旺盛也會加重污染[3]。

2.1.2細菌污染防治為了實現低污染率，在組織培養中除采用常規技術措施之外，還針對性地在培養基中加入殺菌劑如抗生素。抗生素作用原理：慶大霉素、鏈霉素屬于氨基糖苷類型，其與細菌中的30S核蛋白體亞單位結合，抑制細菌的油酸甘油酯合成，通過阻斷其代謝途徑使微生物致死。但抗生素也可能抑制植物組織的葉綠體和線粒體蛋白質的合成，導致植物葉片變小或變黃[4]，而且高濃度抗生素會影響植物生長。在培養基中添加抗生素，選擇合適濃度非常關鍵，濃度低時效果差，濃度高時又容易對植物產生毒害，影響增殖或使培養材料變黑，出現死苗、白化苗等。

將2種及其以上的抗生素結合使用，可以防治細菌的抗藥性。韓美麗等在綠巨人組織培養研究中探討了青霉素、先鋒霉素、慶大霉素對繼代培養中細菌污染的抑制效果，指出先鋒霉素的抑菌效果最好，青霉素和慶大霉素次之[5]；翟建中等研究發現，鏈霉素能防治長春蔓芽繼代培養中出現的細菌[6]。但也有報道發現，多數情況下使用抗生素只能抑制細菌生長而不能將其殺死[7]，抗生素濃度太高對植物有一定毒害作用，而且抗生素一般不穩定，遇酸、堿或加熱易分解而失去活性，這些問題使抗生素的使用受到限制[8]。因此，尋找穩定、耐高溫和高壓的理想抗生素成為控制細菌污染的一個重要課題。

2.2真菌污染

2.2.1真菌污染定義真菌是一類沒有葉綠素、異養的真核微生物。室內真菌種類主要有芽枝孢霉屬、曲霉屬、鉸鏈孢霉屬、鐮刀霉屬、青霉屬等。真菌以腐生、寄生或共生的形式進行營養性生活。真菌數量與溫度、濕度有很大關系。春季、夏季尤其是南方的梅雨時節，溫暖潮濕，非常適合真菌生長。冬季室內真菌濃度較高，如果長期使用空調而不注意通風，可引起室內真菌污染加重。真菌污染出現很快，一般接種后3～5 d 就發現菌絲，繼而很快出現黑、白、黃、綠等孢子。真菌污染一般是由空氣污染、瓶口邊緣和取放封口紙揚起的灰塵、真菌孢子落入器皿中造成的。

2.2.2真菌污染防治常用的滅菌劑有70%乙醇、0.1%～1%氯化汞、3%～10%過氧化氫、1%～10%的漂白粉濾液、05%～10%次氯酸鈉溶液、4～50 mg/L 抗生素。70%乙醇殺菌效果好，有潤濕作用，能排除外植體表層組織的空氣，但穿透力強，應嚴格控制滅菌時間；氯化汞對外植體表面的滅菌效果最好，但殘留的重金屬汞難以去除，其毒害作用在培養一段時間后才能表現出來，因此滅菌后要將材料沖洗干凈；過氧化氫分解后生成有殺菌作用的氧氣，無毒害[9]；漂白粉殺菌效果很好，但須避光、干燥貯存；次氯酸鈉可分解生成有殺菌作用的氯氣而揮發；抗生素可用來去除材料內部組織所帶菌類，但抑菌類型單一、藥效時間短、穩定性差，容易使菌類產生抗藥性，濃度高時影響植物生長，使其應用受到限制[10]。為使滅菌劑能潤濕整個組織表面，可在滅菌劑中加入數滴潤濕劑吐溫-80或吐溫-20，可起到良好的滅菌效果[11]。

嚴格執行無菌操作，定期用甲醛及高錳酸鉀熏蒸對組織培養室消毒。每次使用組織培養室或超凈工作臺時，先用紫外燈殺菌20～30 min，再用75%乙醇噴霧降塵。接種時用75%乙醇的棉球擦拭培養瓶外部，然后再放入超凈工作臺；接種時瓶子要放成45°角，放在火焰上方，利用氣流上升原理，以防止空氣中的孢子落入瓶內，取封口紙時動作要輕。另外，如發現霉菌污染應及時清除。對于外地引進的試管苗，運輸過程中瓶口及封口紙往往積灰塵和孢子，應仔細用75%乙醇擦拭，接種時再燒瓶口，否則容易造成污染。為防止剛引進的材料、剛獲得的無毒材料以及珍貴材料受到污染，用小培養瓶培養，每瓶轉接1芽，雖然培養瓶數量增加，但這是防止稀缺材料污染損失的最有效途徑[12]。

有關抗生素消除細菌的研究較多，但目前對酵母菌污染的研究相對較少，Poulsen等在蘋果分裂組織微生物消除的研究中，測試了幾種物質對酵母菌的毒性，雖然這些物質對植物材料都沒有傷害，但沒有一種物質能夠消除酵母菌。胍類化合物是唯一對2種酵母菌有毒的復合物，但它對分裂組織有毒害作用。霉菌污染的一個重要特點是迅速、難控制。目前關于真菌污染的研究還很少，有人建議用防腐劑去除真菌污染，但有關研究尚未見報道。

另外，培養基中存在有機物是污染產生的重要原因，去除有機物也是減少污染的一條途徑。宋鋒惠等在阿月渾子組織培養的研究中，除去培養基中的VB1、VB6、煙酸等有機成分（保留肌醇），經2～3代培養后，能抑制細菌生長，對叢生芽生長增殖沒有影響。原因是這些有機成分是某些細菌生長的必需物質，除去這些有機物后，細菌無法生長發育而逐漸死亡[13]。日本古在豐樹首創的植物無糖組織培養快繁技術則完全除去了培養基中的有機成分，輸入可控制量的CO2氣體作為碳源，并通過控制環境因子，促進植株光合作用速率，使之由異養型轉變為自養型，因而植株長勢良好，污染率明顯降低[14]。由于去除了糖，組織培養苗由玻璃瓶內培養改為箱式大容器培養，也可將整個培養室作為培養容器，甚至不需要嚴格的無菌操作，也極少被污染，這項技術至少在許多植物組織培養苗的促根階段應用比較成功。

3植物組織培養中污染原因判斷及污染苗搶救

3.1污染原因判斷

如果污染菌類是零星分散在培養基中，則可確定是人為引起的污染。如培養基、接種用具滅菌不徹底；接種室長期不滅菌，接種臺擺放物品雜亂，菌類太多；超凈工作臺長期未換濾網，使凈化能力降低；工作人員操作不正確，動作生硬緩慢，開瓶時間過長，操作中心在人體范圍內。

如果污染菌類是從材料周圍長起，則證明是植物材料帶菌引起，可能是接種工具滅菌不徹底，接種時材料被污染；或是未及時發現污染苗，接種過程中交叉感染。

如果污染菌類是從培養基以上部分長起，而不是先從培養基長起，且發生在5 d以后，則說明是材料自帶的內生菌。

如果污染菌類是從培養基以下開始長菌，發生時間較早，且有從里向外發展的趨勢，則說明是切口引起的污染，原因是滅菌后未剪去2個切口或雖剪切口但器具帶菌。

3.2污染苗搶救

細菌被污染后，由于細菌繁殖靠芽孢，細菌不會彌散整個空間，因此只要及時發現，將材料上部未感菌部分去除轉接，材料仍然可以用；但若真菌被污染，則必須經高溫、高壓滅菌后扔掉，即使僅形成菌絲，因為菌絲能到達材料內部，真菌污染是滅絕性的。

用抗生素等殺菌劑處理，雖有不少報道，但至今未發現有抗生素能對各種菌都有效，并且常會影響植物材料的正常生長分化。有的另一些藥劑雖殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，無法利用。

對已污染的培養物，有時因植物材料難得或重新發生要花費很多時間，也可切取較大植株重新消毒接種。李春燕等分別用400萬、600萬單位/L青霉素無菌水溶液浸泡銀白楊組織培養細菌污染苗40 min以上，可有效防治組織培養中的細菌污染。處理過的苗繼代培養時，不再重復出現細菌污染現象，且苗分化能力強，生根培養時根系發達，移栽成活率高[15]。李穎等研究證明，如果繼代培養中只有真菌污染，采用3%多菌靈無菌液浸泡0.5 h以上即可，用無菌水沖洗后接種或不用無菌水沖洗直接接種都可消除真菌污染。如果在細菌污染和細菌、真菌同時污染的情況下，可采用 HgCl2消毒法把污染培養苗切割成較長莖段作外植體，用自來水沖洗 0.5 h，再在超凈工作臺上用乙醇和HgCl2進行短時間處理，即可再度建立無菌苗培養體系[16]。

4結論

傳統組織培養過程繁雜的技術環節都是圍繞防止污染而制定，控制污染成為組織培養中的首要技術，而植物組織培養污染的控制取決于滅菌技術、滅菌設備、外植體年齡、環境條件等許多方面。盡管在植物組織培養過程中盡量使無菌條件更完善，但污染還是經常發生，甚至有時整個實驗室的組織培養苗突然被污染而全部死亡，造成巨大損失，因而人們對細菌污染研究較多。有些研究人員希望用抗生素防治細菌污染，抗生素可以被直接加入到培養基中，也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體。總之，針對不同植物品種要想找到一種合適的抗生素處理組合比較困難，工作也較繁瑣。一般認為，沒有一

種抗生素對所有細菌都有效，即使有效，抗生素消除植物組織培養污染的方法也是暫時解決方案，如果為消除污染而長期使用抗生素，必然對組織培養苗的生長、分化、生根產生一定影響。隨著科學技術不斷發展和進步，將會出現更高效、節能的新設備、新技術、新方法應用于組織培養技術，從而有效控制污染發生。

參考文獻：

[1]葉添謀. 植物組織培養過程中的常見技術難題研究進展[J]. 韶關學院學報，2010，31（3）：84-90.

[2]吳林森. 植物組織培養污染問題的研究及其控制措施[J]. 江蘇林業科技，2005，32（1）：130-134.

[3]李 云. 林果花菜組織培養快速育苗技術[M]. 北京：中國林業出版社，2001.

[4]Reed B M，Mentzer J，Tanprasert P，et al. Internal bacterial contamination of micropropagated hazelnut：identification and antibiotic treatment[J]. Plant Cell，2004，87（1）：171-176.

[5]韓美麗，陸榮生，黃華艷，等. 綠巨人組培苗繼代培養過程中玻璃化苗及細菌污染的消除方法研究[J]. 廣西林業科學，1999，28（1）：16-19.

[6]翟建中，顧梅俏. 長春蔓組培生產中污染菌的防除[J]. 森林病蟲通訊，1999（4）：30-32.

[7]于福科，張廣軍. 玫瑰組織培養污染控制技術措施[J]. 陜西農業科學，2002（11）：47-48.

[8]周俊輝，周厚高，劉花全. 植物組織培養中的內生細菌污染問題[J]. 廣西植物，2003，23（1）：41-47.

[9]王利民，周毅，陳龍友，等. 植物組織培養中消毒劑的運用[J]. 貴州師范大學學報：自然科學版，2002，20（1）：15-17.

[10]王黎波，李曉燕.抗生素在植物組織培養中控制污染的應用[J]. 遼寧農業科學，2007（3）：69-70.

[11]紀純陽，矯麗曼，劉巍，等. 植物組織培養中污染產生的原因及防止措施[J]. 遼寧林業科技，2011（2）：40-44.

[12]郝云鳳，李可偉，張培宏，等. 植物組織培養操作過程中常見的污染問題及解決辦法[J]. 內蒙古農業科技，2004（增刊）：156-158.

[13]宋鋒惠，李康，史彥江.阿月渾子組織培養及快速繁殖技術研究[J]. 新疆農業科學，2002，39（6）：343-345.

[14]肖玉蘭.植物無糖組培快繁工廠化生產技術[M]. 昆明：云南科技出版社，2003：1-4.

[15]李春燕，李穎. 組織培養中青霉素對細菌污染的抑制作用[J]. 東北林業大學學報，2000，28（5）：97-98.

[16]李穎，李春燕.多菌靈和青霉素在組培污染中的應用[J]. 林業科技，2002，27（1）：6-8.陸玉建， 劉俊華， 王書平，等. 本生煙草愈傷組織的誘導和再生體系的建立[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：52-54.