本生煙草愈傷組織的誘導和再生體系的建立

陸玉建　劉俊華　王書平　高春明　劉曉君　任宇靈

摘要：以本生煙草為材料，研究了不同激素組合對本生煙草愈傷組織誘導和植株再生的影響。結果表明：當本生煙草葉片在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT培養基中培養時，其出愈率最高，愈傷組織生長狀況最好；在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基中不定芽生長最快，但存在一定程度的玻璃化現象；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基中不定芽長勢較慢，但玻璃化程度較輕；對于生根誘導，MS、1/2MS培養基都可誘導不定根的產生，但NAA對根的生長更有效。

關鍵詞：本生煙草；愈傷組織；不定芽；誘導；再生體系

中圖分類號： S572.043；Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0052-03

收稿日期：2013-05-17

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2012CL14）；濱州學院博士基金（編號：2010Y08）。

作者簡介：陸玉建（1979—），男，河南南陽人，博士，講師，研究方向為植物生物技術。Tel：（0543）3190096；E-mail：luyujian79@163.com。煙草是重要的經濟作物，常被作為基因工程和分子生物學研究中重要的模式植物[1-5]。目前煙草遺傳轉化研究多用普通煙草（Nicotiana tabacum）作為受體，而對本生煙草（Nicotiana benthamiana）的研究相對較少。本生煙草和普通煙草有密切的親緣關系[6-7]，由于其植株矮小，生長速度快，生命周期短，對植物病毒非常敏感，所以是基因功能分析和植物病害研究的重要工具[4-8]。有關本生煙草轉基因的研究也見諸報道，通過在本生煙草中瞬時表達促紅細胞生成素基因，能夠生產重組蛋白-促紅細胞生成素[9]。利用本生煙草建立的質體轉化系統，可以用來研究質體和細胞核基因間的相互作用，以及檢測質體中相關基因的表達情況[7]。研究表明，不同煙草品種的組織培養條件有所區別，如果完全按照普通煙草的培養方法培養本生煙草，容易出現外植體褐化、不定芽玻璃化等現象，并且很難獲得再生植株[4-5]。激素是植物組織培養中的關鍵因素，在建立本生煙草再生體系的整個培養過程中，激素的使用起到了非常重要的作用[4-5，10]。因此，如何獲得最佳的激素組合，成為建立本生煙草高效再生體系的關鍵。本研究探索了本生煙草愈傷組織誘導和植株再生的最佳條件，旨在為建立高效的本生煙草懸浮細胞培養體系和遺傳轉化體系奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料和生長條件

本生煙草種子由濱州學院生命科學系實驗室保存，本生煙草生長條件為：每天16 h光照、8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度控制在25 ℃左右，光照強度為2 200 lx。

1.2方法

1.2.1種子消毒和無菌苗獲得將本生煙草種子用0.1%氯化汞溶液消毒10 min，無菌水漂洗5～6次，接種到MS基本培養基中培養。

1.2.2培養基配制培養基的配制方法見表1。所有培養基中均添加3%蔗糖和0.8%瓊脂。不定芽增殖培養基為MS基本培養基。

表1不同培養基的組成

培養基類型1編號1激素組合愈傷組織誘導1R11MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT1R21MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT1R31MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT1R41MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT不定芽誘導1y11MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA1y21MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA1y31MS +1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA1y41MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA生根誘導1yc111/2MS+0.1 mg/L IBA1yc21MS+0.1 mg/L IBA1yc311/2MS+0.1 mg/L NAA1yc41MS+0.1 mg/L NAA

1.2.3結果觀測與統計方法外植體接種30 d后進行增殖培養，并統計出愈率、不定芽分化率、生根率。有關計算公式如下：

出愈率=（產生愈傷組織的外植體數/接種的外植體數）×100%；

不定芽分化率=（產生不定芽的外植體數/接種的外植體數）×100%；

生根率=（產生不定根的外植體數/接種的外植體數）×100%。

2結果與分析

2.1愈傷組織的誘導

以生長30 d的無菌苗葉片為外植體，接種到愈傷組織誘導培養基中（圖1-A）。在接種后第10天可以觀察到本生煙草葉片發生明顯卷曲，在葉片邊緣產生肉眼可見的乳白色顆粒狀愈傷組織（圖1-B）。繼續培養至22 d時，在葉片上形成了成團的愈傷組織，結構疏松，生長十分旺盛（圖1-C）。

2.2不定芽的形成

本生煙草葉片接種到不定芽誘導培養基中12 d后，葉片邊緣出現少量深綠色芽點（圖1-D）。接種后第 26天芽點已經形成明顯的不定芽（圖1-E）。

2.3生根誘導

切取不定芽，接種到生根培養基中培養（圖1-F）。在生根誘導的第12天可以看到不定芽基部已形成明顯的根（圖1-G）。最后選取生長旺盛的試管苗進行馴化和移栽（圖1-H）。

2.4激素對愈傷組織誘導的影響

為了研究不同激素組合對本生煙草愈傷組織誘導的影響，分別對不同誘導培養基中葉片愈傷組織的生長情況進行觀察分析。結果顯示，在葉片接種后的第30天，雖然這4種培養基均可誘導葉片產生愈傷組織，并且誘導率幾乎都為100%，但產生愈傷組織的數量和質量存在差異。R3培養基中產生愈傷組織的質量最好，愈傷組織色澤均勻而透明，生長迅速，堆積的團塊明顯較大（圖2-C）；雖然R4培養基中產生愈傷組織的數量較多，但質量有所下降（圖2-D）；R1、R2培養基也能誘導葉片產生愈傷組織，但愈傷組織的誘導效果相對較差，尤以R1表現的更為明顯（圖2-A、圖2-B）。上述結果表明，1 mg/L 2，4-D和0.2 mg/L KT為誘導本生煙草愈傷組織的最佳激素組合，這時本生煙草葉片細胞脫分化的能力最強，細胞分裂最為旺盛。

2.5激素對不定芽誘導的影響

為了獲得本生煙草不定芽誘導的最佳激素組合，分別對不同誘導培養基中葉片不定芽的生長情況進行觀察分析。結果顯示，在葉片接種后第30天，雖然這4種培養基均可誘導葉片產生不定芽，但不定芽產生的數量和速度存在差異。y1培養基中不定芽產生最早、生長最快、數量最多（圖2-E）；與y1培養基相比，y2培養基誘導產生不定芽的時間有所延長，不定芽生長速度稍慢，數量略有下降（圖2-F）。在y1、y2培養基中，不定芽分化率都在90%以上。y4培養基中不定芽生長較為緩慢（圖2-H），不定芽分化率大概為80%；y3培養基中不定芽長勢最差（圖2-G），不定芽分化率僅為60%左右。此外觀察發現，在y1、y2培養基中許多不定芽呈半透明的水浸狀，表現出明顯的玻璃化現象，并且培養時間越長，這種現象越明顯。但在y4培養基中不定芽并沒有表現出明顯的玻璃化。根據以上結果，可以認為不定芽誘導最適培養基為y1培養基，但須要在不定芽產生早期進行增殖培養，以減少玻璃化的發生；y4培養基則適于不定芽的長期培養。

3結論與討論

植物激素是植物細胞生長最適宜的調節物質[11]。生長素常用來誘導愈傷組織的形成和根的分化[11-13]；細胞分裂素的主要生理作用是促進細胞分裂、誘導芽的形成、促進芽的生長[11，13]。2，4-D對啟動植物細胞脫分化十分重要，研究表明隨著2，4-D濃度的增大，植物愈傷組織的誘導能力逐漸增強，但超過一定濃度時，反而對愈傷組織的誘導起抑制作用。本研究表明，本生煙草愈傷組織誘導的最適2，4-D濃度為1 mg/L，該條件下本生煙草葉片細胞脫分化的能力最強，細胞分裂最為旺盛。

KT是一種細胞分裂素，能促進脫分化的細胞保持旺盛的分裂能力，因此在培養基中添加低濃度KT有助于愈傷組織生長和增殖，但KT濃度不宜過高，否則會對細胞分裂起抑制作用。對于本生煙草而言，比較合適的KT濃度為0.2 mg/L。在不定芽誘導過程中，6-BA 和NAA是2種關鍵成分，它們之間必須維持一個合適比例。當6-BA、NAA濃度分別為15、0.1 mg/L時，不定芽產生較多，生長速度較快，但存在一定程度的玻璃化現象；當6-BA濃度達到3.0 mg/L，不定芽長勢較慢，但玻璃化程度較輕?？梢姡m當提高6-BA濃度在一定程度上可減少不定芽玻璃化的產生，這和蘇上等的研究結果一致[4]，而和崔海濤等的研究結果稍有不同[5]。在本生煙草培養過程中，極易產生玻璃化現象，導致試管苗分化能力降低[14-15]。為了減少試管苗的玻璃化，一種方法是適當提高6-BA濃度，但不定芽產生數量較少；另一種方法是在 6-BA 濃度較低的情況下，先誘導產生較多的不定芽，然后在不含激素的培養基中及時進行繼代增殖培養，這樣可以降低不定芽出現玻璃化的概率。綜上，為了得到更多的不定芽，比較適宜的激素組合為1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，但須要在不定芽形成早期及時進行增殖培養。

對于生根誘導，無論是MS培養基還是1/2MS培養基，都可誘導不定根的產生；相比之下，在含0.1 mg/L NAA的培養基中，不定根長勢相對較好，根系比較旺盛。

本生煙草具有普通煙草無可比擬的優點，已成為生命科學基礎理論研究中十分重要的模式植物。本研究探索了本生煙草愈傷組織誘導和再生體系建立的最適條件，對于今后進行單細胞培養和次生代謝物生產，植物遺傳轉化和性狀改良都具有一定參考價值。

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