不同取材時期和處理方法對瓦松無菌體系建立的影響

李慶偉　梁明勤　樊亞敏　劉榮寧　賀愛利

摘要：以瓦松植株為外植體進行組織培養，探索不同取材時期、處理方法、消毒時間、激素配比等對其無菌體系建立的影響，結果表明，無菌體系建立的材料以5月上旬取材、取材后對材料進行假植處理、剪去新萌生的莖段作為外植體為宜；材料用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min后接種，污染率在5%以下，存活率在92%以上；在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的啟動培養基中，芽啟動率為99.78%，外植體并沒有出現愈傷組織、玻璃化等現象。

關鍵詞：瓦松；取材時期；處理方法；無菌體系

中圖分類號： Q945.52文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0055-03

收稿日期：2013-05-09

基金項目：河南農業職業學院重點項目（編號：HNAC2011KY002）。

作者簡介：李慶偉（1979—），男，河南封丘人，碩士，講師，研究方向為種苗繁育與大蒜生產。E-mail：liqingwei2003@163.com。瓦松（Orostachys fimbriatus）別稱瓦花、瓦塔、瓦玉等，為景天科瓦松屬2年生草本肉質植物，在河南、江蘇等省及朝鮮、日本等國家和地區有分布[1]。瓦松植株中含有多種酸類、景天庚酮糖苷及異丙叉基景天庚酮糖苷等物質[2-5]，主要用于藥物合成，目前，利用瓦松參與合成的藥品不下27種。在臨床上，主要用于治療宮頸糜爛、腎性皮膚瘙癢、痔瘡、口腔潰瘍等癥狀[6-9]。隨著研究深入，以瓦松為原材料加工而成的藥品，將更多地應用在臨床上。自然條件下，瓦松生存完全依靠自生自滅。近年來，由于受氣候異常變化、花期采藥、生境發生變化等影響，瓦松資源受到嚴重破壞，保護瓦松資源刻不容緩。目前，國內外并沒有發現關于瓦松繁殖，尤其是快速繁殖的研究報道。探索并利用生物技術手段，對瓦松進行種苗繁育技術研究，對深度挖掘瓦松的潛在藥用價值，進一步加快瓦松的開發利用具有十分重要的意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料采于當地農村15年以上的瓦房上，分別在2月上旬、5月上旬、7月上旬、10月上旬拔取全株瓦松，用帶葉莖段作為接種材料。

1.2外植體消毒

采用2種外植體選擇方法進行消毒。方法1為直接消毒接種：在自來水下清洗表面泥土與灰塵，后剪成3～5 cm長莖段，用自來水沖洗30 min，對2月上旬采集的材料，去根、留蓮座狀葉和芽，直接用水沖洗；置于超凈工作臺上用0.1% HgCl2分別浸泡2、4、6、8、10、12、14 min，無菌水沖洗4次，瀝干水于無菌紙上。方法2為假植后消毒接種：材料假植于花盆中，套塑料袋，于室內25 ℃下培養5～7 d；剪新萌生嫩莖直接用0.1% HgCl2消毒，消毒時間同上。

消毒后莖段，剪成帶葉的莖段接種于初代培養基中，每瓶接種1個莖段，每個處理均接種15瓶。

1.3材料培養

初代培養基，以MS培養基為基本培養基，采用2因素完全隨機設計（表1）。培養基采用高壓蒸汽滅菌，在121 ℃、1.1 kg/cm2 壓力下滅菌15 min。接種材料置于溫度24～26 ℃、光照時間14 h/d、光照強度 30 μmol/（m2·s） 的條件下進行培養。

1.4數據統計與分析

接種后2 d開始調查，后每隔3 d調查1次，記載污染發生的時間、類型、部位，外植體受傷害情況，腋芽初始萌動時間、腋芽萌動程度、材料的生理狀態等，接種后22 d統計污染情況，接種后30 d統計材料存活、傷害情況、腋芽萌動等。根據統計結果計算污染率、存活率、啟動率等，公式如下：污染率=污染外植體數/接種總數×100%；存活率=存活個體數/接種總數×100%；啟動率=萌芽個體數/接種總數×100%。

數據用SPSS 13.0軟件進行方差分析，采用鄧肯氏新復極差測驗進行多重比較。試驗中全部處理小于1的百分數，經反正弦轉換后，進行分析和比較。

2結果與分析

2.1取材時期和方法對無菌體系建立的影響

由圖1可見，瓦松取材時期和方法不同，組培苗污染率存在很大差異；2月上旬取材后直接消毒接種（方法1）污染率最高，達100%，10月上旬、7月上旬取材次之；5月上旬取材污染率最低，2種方法平均污染率22.2%。這可能是由于5月瓦松種子萌動后剛開始大量生長，生命力較旺盛，且外植體在空氣中暴露時間較短，隨著在空氣中暴露時間的增加，外植體表面匯集大量微生物，組織培養時直接進行消毒，并不能將表面的微生物全部殺死；進入冬季，瓦松植株為適應環境條件變化，進入休眠，整個植株生長停止，葉片緊緊閉合，體內積累大量微生物，消毒時，消毒劑只能將裸露在表面的微生物殺死，并不能殺死植株內的微生物，從而造成2月份污染率居高不下。從選用不同的外植體進行消毒接種看，在同一時期，直接消毒接種的組培苗污染率均高于假植后消毒接種的（方法2）。5月份是瓦松最佳的取材時期，外植體假植后，選取植株上萌生的新莖段作為外植體，可使組培苗污染率最低。

2.2消毒時間對無菌體系建立的影響

由表1可見，隨著HgCl2消毒時間的增加，外植體的污染率明顯降低；對于選用不同外植體進行消毒接種，方法1組培苗的污染率和HgCl2消毒時間成負相關性，消毒時間越長，污染率越低，2、4 min處理的污染率最高（100%），12、14 min處理的污染率最低（0），且外植體的存活情況不受影響，這說明外植體表面存在大量保護組織，能避免受傷害，方法2組培苗的污染率和HgCl2消毒時間也表現為負相關性，其外植體的存活情況（存活率）和消毒時間也成負相關關系，消毒時間越長，受傷害的外植體材料越多，存活率越低，這說明假植處理后，新萌生的莖段表面缺乏保護性組織；對于在相同的消毒時間條件下，方法2組培苗的污染率要明顯低于方法1，這可能與二者的生長環境有關，方法1的植株長期暴露在自然環境下，其體表攜帶大量的微生物，而方法2新萌生的莖段，可能攜帶微生物含量少，但對于存活率，消毒時間較短時表現不明顯，隨著消毒時間的增長，方法2組培苗的存活率明顯低于方法1，這可能與二者的生理狀態有關，經過假植的瓦松苗組織相對更幼嫩一些。

綜合瓦松外植體的污染率、存活率及其處理方法等指標，認為采用假植后剪取新生莖段，0.1% HgCl2浸泡10 min作為瓦松無菌體系建立外植體消毒的最佳時間。

為檢驗0.1 HgCl2消毒10 min對假植后新生莖段的效果，通過消毒較長莖段或消毒后每瓶接種多個材料進行驗證（圖2），發現材料的存活率在92%以上，污染率在5%以下。

2.3激素組成對瓦松外植體啟動培養的影響

初代培養中以MS培養基為基本培養基，培養基中添加不同的濃度NAA和6-BA，瓦松外植體的啟動培養結果如表2和圖3所示。

從表2可以看出，瓦松的腋芽最早在接種1周后才開始萌動。腋芽的萌動時間受培養基中激素配比的影響而不同：培養基僅含有NAA時，芽的初始萌動時間隨NAA濃度的增加而延長，在NAA濃度為0.5 mg/L時，接種后30 d，沒有觀察到腋芽萌動；僅含有6-BA的培養基，隨6-BA濃度的增加，腋芽萌生時間也明顯延遲，6-BA濃度為1.0 mg/L時，接種后30 d同樣也沒有發現腋芽萌動；當NAA和6-BA同時存在于培養基中，在培養基中6-BA濃度為0.1 mg/L，NAA濃度為0.1、0.3 mg/L時，瓦松腋芽萌動的時間都明顯提早；培養基中6-BA濃度提高為 0.5 mg/L，無論培養基中NAA濃度是高是低，瓦松腋芽萌動的初始時間都明顯提前，最早接種后8 d腋芽開始萌動；當培養基中NAA濃度為0.5 mg/L，6-BA 濃度為0.1、1.0 mg/L時，接種后30 d均沒有觀察到瓦松腋芽的萌發；培養基中不添加任何激素，腋芽初始萌生時間為接種后20 d。瓦松外植體在不同的培養基中，其腋芽的初始萌生時間呈現不同，這可能與所添加生長調節劑的特性有關：NAA是生長素類物質，能明顯促進材料體內細胞的生長，它在低濃度時，可以促進材料不定根產生；濃度較高時，則會產生愈傷組織，抑制芽的發生。6-BA為細胞分裂素類物質，能促進細胞分裂，促進不定芽和叢生芽的形成；過高濃度時，會出現玻璃化等不良現象，抑制芽的發生。

另外，瓦松腋芽的啟動率在添加一種激素的培養基中隨添加激素濃度的增加而降低；在同時添加2種激素的培養基中，在6-BA濃度為0.1、0.5 mg/L時，隨NAA濃度的提高，芽啟動率降低；當6-BA濃度為 1.0 mg/L 時，NAA濃度過低（0.1 mg/L）或過高（0.5 mg/L）出現腋芽啟動率反而沒有 0.5 mg/L 的芽啟動率高；培養基中不添加任何激素，瓦松的腋芽也全部萌發，芽萌發后生長緩慢，沒有根系發生（表2）。

對各處理進行顯著性分析發現，不同處理間達到顯著水平，處理組合7（A2B3）和處理組合5（A2B1）極顯著高于其他組合，處理組合16（A4B4）、13（A4B1）、4（A1B4）最差，處理組合8（A2B4）、14（A4B2）效果也比較差。

綜合外植體接種后的萌生速度、啟動率、生理狀態等基本表現，瓦松初代培養的培養基以MS+NAA0.1mg/L+6-BA表2不同激素配比對瓦松外植體啟動培養的影響

3小結與討論

材料消毒是建立植物組織培養無菌再生體系的第一步，它直接關系到無菌體系能否建立，因此格外關鍵。許多研究指出，不同的植物種類、外植體類型、不同的生理狀態及取材季節，所采用的外植體處理和消毒方式均不相同[10-14]。朱淑穎等在研究野生草珊瑚快繁體系建立時，發現直接使用消毒劑對外植體材料進行消毒，初代培養的污染率幾乎為100%，其指出，選取的外植體材料源自野外的植株，葉表面孳生著大量微生物，并附著大量的霉菌孢子和細菌芽孢，甚至一些菌絲體進入表皮薄壁細胞，直接消毒難以奏效[10]。王麗萍等在進行番木瓜組織培養時，指出以大田番木瓜作外植體，很難控制污染，如果在番木瓜外植體使用消毒劑前用熱水進行浸泡處理10 min，污染率同比降低了28.62%[11]。德慶措姆以西藏林芝地區野生銀白楊萌蘗苗為材料，研究銀白楊的消毒技術時發現，其體表密被白絨毛，直接影響消毒劑的滲入和減低消毒效果[12]。宋會訪研究桂花的植物組織培養時，發現桂花莖段腋芽表面吸附大量雜菌，且枝條內部有內生菌存在，消毒難以控制，而新生的枝條和葉片中雜菌較少，容易消毒處理[13]。王延玲等在仙客來花藥培養中，同樣也指出材料表面的微生物難以消除徹底，不利于消毒處理[14]。本試驗以野生瓦松莖段為外植體材料，比較了直接消毒接種和經過假植后剪新萌莖段接種2種處理方式對污染、存活率等的影響，發現假植后消毒雖能降低污染率，但材料的存活率大幅度下降，這和前人研究基本一致。主要原因是材料表面存在大量微生物，消毒劑難以將有些芽孢孢子殺死，通過假植后選取莖段，則能明顯降低污染率，說明材料暴露空氣中的時間越短，其攜帶微生物含量越少，也驗證了前人的研究[12-15]。

瓦松為2年生植物，野生狀態下，其生長狀態受自然環境制約很大，華北地區春季3—4月多缺乏雨水，繼而瓦松種子不能很好進行發芽產生新植株，1年生植株同時也因缺乏水分而生長受限，因此，應結合瓦松的生物學特性和環境條件來合理取材。馬翠萍在1年中1月、3月、6月、9月、11月等5個時期分別對冬棗、一品紅、楊樹、櫻桃、草莓進行取材研究，指出取材時應注意避免高溫季節和材料的休眠期，盡量根據材料生物學特性和季節結合進行選擇[15]，這和本試驗結果基本相同。郭曉東以桃樹1年生萌蘗和當年生上部枝條為試材，研究了3月、8月和11月取材對污染的影響，發現11月污染率最低、8月最高，但材料的啟動率卻以8月最高、11月

最低，綜合分析以3月外植體作為材料最好[16]，這也說明瓦松的取材在考慮季節因素和生物學特性時，應結合試管苗的生理狀態來判定最佳的取材時期。

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