蘿卜下胚軸高效再生體系的建立

李媛媛　王冰林　韓佳　鄭慧敏　何珊　胡玉榮　張軍

摘要：以7個蘿卜品種為試材，開展下胚軸離體培養研究，通過基因型篩選確定具有較高再生頻率的蘿卜品種進行后續試驗，探討AgNO3濃度、激素配比、瓊脂濃度等因素對蘿卜下胚軸再生的影響。結果表明：蘿卜下胚軸再生的最適培養基為改良MS+1.8 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3+0.9%瓊脂+30 g/L 蔗糖，不定芽再生率高達78.3%，玻璃化率僅為2.8%。

關鍵詞：蘿卜；下胚軸；離體再生；AgNO3；激素配比

中圖分類號： S631.104.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0058-03

收稿日期：2013-05-16

基金項目：山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金（編號：2007BS06024）；山東省農業良種工程重大課題。

作者簡介：李媛媛（1979—），女，山東桓臺人，博士，講師，從事蔬菜遺傳育種研究。Tel：（0536）8785690；E-mail：yylilove@126.com。

通信作者：王冰林，博士，副研究員，從事蔬菜遺傳育種與栽培生理研究。Tel：（0536）2118661；E-mail：binglinwang@126.com。蘿卜是一種重要的營養保健蔬菜，在我國蔬菜栽培和供應中占有重要地位，近幾年種植面積不斷擴大，產量也在逐步提高，目前全國蘿卜栽培面積約為120萬hm2/年，總產量達 2 683萬t/年[1]。蘿卜生產以應用雜交種為主，自交不親和系和雄性不育系利用是蘿卜雜交育種的重要途徑，而其傳統的保存方法局限性較大。隨著生物技術的快速發展，組織培養成為保存和快繁自交不親和系和雄性不育系的有效途徑，同時也是利用基因工程技術選育優良品種的重要前提。蘿卜為再生頑拗型植物，再生頻率普遍較低[2]，所以建立高效、實用的離體再生體系和組培快繁體系成為蘿卜生物技術育種的關鍵限制因素。因此，筆者選用7個蘿卜品種，從基因型、激素配比、AgNO3濃度、瓊脂濃度等方面對蘿卜下胚軸再生的影響進行了研究，旨在建立高效的蘿卜離體再生體系，為利用生物技術與常規育種方法相結合開展蘿卜遺傳育種和良種繁育提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試7個蘿卜品種由山東省濰坊市農業科學院提供，分別為雜交種紅光102、白玉冠軍、濰蘿卜1號、濰蘿卜2號、濰蘿卜3號，常規種濰縣蘿卜、改良濰縣蘿卜。

1.2試驗方法

1.2.1無菌苗培養挑選顆粒飽滿的蘿卜種子，用蒸餾水清洗干凈后用濾紙吸干。在超凈工作臺上用70%乙醇處理 30 s，再用0.1%氯化汞處理8 min，無菌水沖洗4～5遍，然后接種于1/2MS培養基（含20 g/L 蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，pH值 5.8～6.0）上。每個三角瓶接種5～10粒種子，置于25 ℃、光照時間16 h/d、光照強度2 000 lx條件下培養，獲得無菌苗。

1.2.2不定芽誘導切取生長4～5 d的無菌苗下胚軸（切段長5～10 mm），接種于改良培養基（MS+5 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+7.5 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖）上，每瓶接種 4～5個外植體。在溫度25 ℃、光照時間16 h/d、光照強度 2 000 lx 條件下培養15～20 d，統計不定芽再生率及玻璃化率，選出再生頻率較高的蘿卜基因型。以再生情況最好的基因型為材料，篩選合適的激素（6-BA和NAA）濃度配比、AgNO3 濃度和瓊脂濃度。愈傷再生率=（形成愈傷的外植體數/接種的外植體總數）×100%；愈傷褐化率=（褐化的愈傷數/愈傷總數）×100%；不定芽再生率=（形成再生芽的外植體數/接種的外植體總數）×100%；玻璃化率=（玻璃化芽數/芽總數）×100%。

1.2.3不定根誘導外植體培養15～20 d后，愈傷組織基本脫分化出不定芽，將不定芽切割成小塊，接于1/2MS基本培養基上誘導生根。

2結果與分析

2.1不同基因型對蘿卜下胚軸再生的影響

在改良培養基（MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7.5 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖）上培養5 d左右，蘿卜下胚軸兩端開始膨大，10 d左右形成明顯的愈傷組織，15 d左右長出不定芽。在供試的7個蘿卜品種中，改良濰縣蘿卜不定芽再生率最高，達48.2%，其次為濰蘿卜3號，其他品種不定芽再生率較低，且愈傷褐化率、玻璃化率偏高；白玉冠軍雖然愈傷再生率最高，但未長出不定芽（表1），所以選擇改良濰縣蘿卜為試材進行后續試驗，圖1為該品種下胚軸離體培養各階段的生長狀況。

2.2不同AgNO3濃度對蘿卜下胚軸再生的影響

由表2可知，在培養基中添加AgNO3可提高改良濰縣蘿卜品種下胚軸愈傷再生率和不定芽再生率，而降低愈傷褐化率和玻璃化率，且隨著濃度增加，變化幅度加大。鑒于AgNO3對植物生長具有毒害作用，濃度過高會抑制蘿卜不定芽生長，宜選擇5 mg/L。

3結論與討論

蘿卜是再生頑拗型植物，基因型對蘿卜再生能力影響較大[3-5]。在本研究所用的7個蘿卜品種中，改良濰縣蘿卜下胚軸再生率達到48.2%，而白玉冠軍下胚軸再生率為0，品種間存在較大差異。王洋等認為，對于具有高頻再生潛力的基因型，通過改良培養基能夠建立一個高頻再生體系[6]。所以，改良濰縣蘿卜可作為下胚軸再生的較理想基因型。

關于蘿卜離體再生的研究較少，主要以子葉和下胚軸為外植體。徐文玲等以蘿卜帶柄子葉為外植體，建立了再生率較高的再生體系[2，7-8]。在早期，崔群香等對蘿卜下胚軸離體再生進行了初步探討，但對離體再生的影響因素及不定芽再生率缺乏系統研究[9-10]。王輝等將誘導出的45塊愈傷組織進行培養，僅分化出3個芽，再生率很低[11]。本研究以再生頻率較高的改良濰縣蘿卜品種為試材，系統研究了AgNO3濃度、激素配比、瓊脂濃度等因素對蘿卜下胚軸再生的影響，建立了蘿卜下胚軸愈傷誘導率100%、不定芽再生率78.3%、玻璃化率僅為2.8%的高效再生體系，其最適改良培養基為 MS+1.8 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3+ 9 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖，這為利用生物技術進行蘿卜育種和制種工作奠定了良好基礎。

參考文獻：

[1]陳寶剛，魯建斌，梁玉芹. 蘿卜育種研究進展[J]. 河北農業科學，2012，16（1）：65-68.

[2]徐文玲，王淑芬，何啟偉，等. 蘿卜高頻再生體系的建立[J]. 山東農業科學，2006（6）：7-10.

[3]Matsubara S，Hegazi H H. Plant regeneration from hypocotyl callus of radish[J]. Horti Science，1990，25（10）：1286-1288.

[4]Pua E C，Sim G E，Chi G L，et al. Synergistic effect of ethylene inhibitors and utrescine on shoot regeneration from hypocotyl explants of Chinese radish（Raphanus sativus L.var. longipinnatus Bailey） in vitro[J]. Plant Cell Reports，1996，15：685-690.

[5]Takahata Y，Komatsu H，Kaizuma N. Microspore culture of radish（Raphanus sativus L.）：influence of genotype and culture conditions on embryogenesis[J]. Plant Cell Reports，1996，16：163-166.

[6]王洋，崔繼哲，李翠玲.大白菜高頻再生體系的建立及策略[J]. 園藝學報，2005，32（4）：701-703.

[7]武劍，龔義勤，鄧波，等. 蘿卜離體再生的影響因素[J]. 中國蔬菜，2003（6）：6-8.

[8]李海萍，張魯剛，張靜，等. 蘿卜帶柄子葉高頻再生體系的建立[J]. 植物學報，2011，46（3）：331-337.

[9]崔群香，汪隆植，婁平，等. 從蘿卜下胚軸再生完整植株[J]. 南京農專學報，1999，15（4）：29-36.

[10]祝仲純，吳海珊. 從蘿卜的下胚軸誘導植株成功[J]. 遺傳，1980，2（3）：36.

[11]王輝，田義軻，劉維信，等. 蘿卜組織和器官的離體培養[J]. 青島農業大學學報：自然科學版，2009，26（2）：109-112.于亞輝，孫濱，夏明，等. 利用程氏指數分析兩系雜交粳稻親本秈粳成分與產量及其構成因素的關系[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：61-63.

參考文獻：

[1]陳寶剛，魯建斌，梁玉芹. 蘿卜育種研究進展[J]. 河北農業科學，2012，16（1）：65-68.

[2]徐文玲，王淑芬，何啟偉，等. 蘿卜高頻再生體系的建立[J]. 山東農業科學，2006（6）：7-10.

[3]Matsubara S，Hegazi H H. Plant regeneration from hypocotyl callus of radish[J]. Horti Science，1990，25（10）：1286-1288.

[4]Pua E C，Sim G E，Chi G L，et al. Synergistic effect of ethylene inhibitors and utrescine on shoot regeneration from hypocotyl explants of Chinese radish（Raphanus sativus L.var. longipinnatus Bailey） in vitro[J]. Plant Cell Reports，1996，15：685-690.

[5]Takahata Y，Komatsu H，Kaizuma N. Microspore culture of radish（Raphanus sativus L.）：influence of genotype and culture conditions on embryogenesis[J]. Plant Cell Reports，1996，16：163-166.

[6]王洋，崔繼哲，李翠玲.大白菜高頻再生體系的建立及策略[J]. 園藝學報，2005，32（4）：701-703.

[7]武劍，龔義勤，鄧波，等. 蘿卜離體再生的影響因素[J]. 中國蔬菜，2003（6）：6-8.

[8]李海萍，張魯剛，張靜，等. 蘿卜帶柄子葉高頻再生體系的建立[J]. 植物學報，2011，46（3）：331-337.

[9]崔群香，汪隆植，婁平，等. 從蘿卜下胚軸再生完整植株[J]. 南京農專學報，1999，15（4）：29-36.

[10]祝仲純，吳海珊. 從蘿卜的下胚軸誘導植株成功[J]. 遺傳，1980，2（3）：36.

[11]王輝，田義軻，劉維信，等. 蘿卜組織和器官的離體培養[J]. 青島農業大學學報：自然科學版，2009，26（2）：109-112.于亞輝，孫濱，夏明，等. 利用程氏指數分析兩系雜交粳稻親本秈粳成分與產量及其構成因素的關系[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：61-63.

參考文獻：

[1]陳寶剛，魯建斌，梁玉芹. 蘿卜育種研究進展[J]. 河北農業科學，2012，16（1）：65-68.

[2]徐文玲，王淑芬，何啟偉，等. 蘿卜高頻再生體系的建立[J]. 山東農業科學，2006（6）：7-10.

[3]Matsubara S，Hegazi H H. Plant regeneration from hypocotyl callus of radish[J]. Horti Science，1990，25（10）：1286-1288.

[4]Pua E C，Sim G E，Chi G L，et al. Synergistic effect of ethylene inhibitors and utrescine on shoot regeneration from hypocotyl explants of Chinese radish（Raphanus sativus L.var. longipinnatus Bailey） in vitro[J]. Plant Cell Reports，1996，15：685-690.

[5]Takahata Y，Komatsu H，Kaizuma N. Microspore culture of radish（Raphanus sativus L.）：influence of genotype and culture conditions on embryogenesis[J]. Plant Cell Reports，1996，16：163-166.

[6]王洋，崔繼哲，李翠玲.大白菜高頻再生體系的建立及策略[J]. 園藝學報，2005，32（4）：701-703.

[7]武劍，龔義勤，鄧波，等. 蘿卜離體再生的影響因素[J]. 中國蔬菜，2003（6）：6-8.

[8]李海萍，張魯剛，張靜，等. 蘿卜帶柄子葉高頻再生體系的建立[J]. 植物學報，2011，46（3）：331-337.

[9]崔群香，汪隆植，婁平，等. 從蘿卜下胚軸再生完整植株[J]. 南京農專學報，1999，15（4）：29-36.

[10]祝仲純，吳海珊. 從蘿卜的下胚軸誘導植株成功[J]. 遺傳，1980，2（3）：36.

[11]王輝，田義軻，劉維信，等. 蘿卜組織和器官的離體培養[J]. 青島農業大學學報：自然科學版，2009，26（2）：109-112.于亞輝，孫濱，夏明，等. 利用程氏指數分析兩系雜交粳稻親本秈粳成分與產量及其構成因素的關系[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：61-63.