拮抗農業致病真菌放線菌菌株CTF619—D的分離、篩選及初步鑒定

康敬芹　呂躍東　王勇　劉楊　張良

摘要：從黃河中分離篩選出若干放線菌菌株，并對放線菌菌株進行分離純化，采用瓊脂塊法進行初篩，用紙片擴散法和生長速率法對抑菌效果較好的菌株進行抑菌活性復篩，發現菌株CTF619-D的發酵產物對番茄炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、蘋果腐爛病菌等10多種真菌均有不同程度的抑制作用，其中對番茄炭疽病菌的抑菌圈最大能達到2.8 cm。通過對CTF619-D菌株形態特征、培養特征、生理生化特征、16S rDNA序列及系統發育分析等方面的研究發現，CTF619-D菌株與淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）FSHJ9菌株的序列同源性達100%，但在形態特征、培養特征和生理生化特性方面與其存在差異，因此初步確定CTF619-D為淡紫灰鏈霉菌的一個新變種。

關鍵詞：放線菌；拮抗；生理生化；16S rDNA

中圖分類號：S182文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0086-04

收稿日期：2013-06-06

基金項目：遼寧省教育廳項目（編號：2009A374）。

作者簡介：康敬芹（1987—），女，山東樂陵人，碩士研究生，研究方向為生物制藥及劑型加工與應用。E-mail：xiaokang586@126.com。

通信作者：呂躍東，副教授，主要從事生物制藥及劑型加工與應用研究。E-mail：lyd9900@163.com。放線菌是一類具有廣泛實際用途和巨大經濟價值的微生物資源。它突出的特性之一是能產生大量的、種類繁多的抗生素，是生產抗生素的主要菌群，是研制新醫藥、新農藥和生物防治活菌劑的源頭[1]。據估計，在全世界發現的8 000多種生物活性物質中，近70%是由放線菌產生的[2]。因此，為了達到高效、環保的生物防治目的，篩選和利用拮抗放線菌已成為當前農業科學研究的熱點之一。在新抗生素的篩選分離過程中，從黃河土壤中分離出了1株具有較強活性的放線菌菌株CTF619-D，該菌株對多種植物農業病原真菌具有較強的抑制作用。本研究主要對該菌株的形態特性、培養特征、生理生化特征、16S rDNA序列及系統發育分析等方面進行分析，以確定其分類地位，并對活性成分的抗菌譜進行初步研究，旨在發現新的抗生素或原有抗生素新的防治特性，為豐富防治水果蔬菜病菌的生物農藥種類提供實踐經驗和理論依據，為農用抗生素的研究與應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試放線菌放線菌由采自黃河的不同水樣和土樣中分離得到。

1.1.2供試病原菌以下病原菌均由遼寧科技大學生物工程系生物制藥工藝室提取：（1）香蕉灰紋病菌（Cordana musae）；（2）油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；（3）黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）；（4）番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）；（5）辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）；（6）黃瓜黑星菌（Cladosporium cucumerinum）；（7）番茄葉霉病菌（Fulvia fulva）；（8）水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）；（9）番茄炭疽病菌（Colletotrichum lycopersici）；（10）稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）；（11）小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）；（12）棉花黃萎病菌（Fusarium oxysporum）；（13）小麥根腐霉病菌（Helminthosporium sorokinianum）；（14）蘋果腐爛病菌（Cytospora sp.）；（15）黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）；（16）水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）；（17）小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）；（18）稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）；（19）黃瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）；（20）姜瘟病菌（Pseudomonas solanacearum）。

1.1.3培養基分離所用培養基：高氏一號培養基+重鉻酸鉀[3-5]（0.6×10-6～0.7×10-6 g/L），pH值為7.4；放線菌培養所用培養基：高氏一號瓊脂培養基；病原菌培養及拮抗試驗所用培養基：PDA培養基；鑒定所用培養基參照《放線菌：屬和種的分類、鑒定和描述》[6]。

1.1.4主要儀器與設備LRH-250A型生化培養箱，TGL-16C型高速離心機，ZHWY-2102型恒溫培養振蕩器，Autoelavo ES-315型高壓滅菌鍋，T-203型電子天平，SW-CJ-5 型超凈工作臺，Motic BA400型數碼成像光學顯微鏡，JSM-6360LV型電子掃描顯微鏡，TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600型PCR擴增儀，Mupid型核酸電泳儀，Image Master VDS電泳成像裝置，EPS300型蛋白質電泳儀，ABI PRISMTM 3730XL DNA Sequencer型DNA測序儀。測序用試劑：BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit 試劑盒；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒。

1.2方法

1.2.1放線菌的分離和純化將土壤自然風干，在28 ℃條件下放置5～7 d，用研缽磨細以重鉻酸鉀[3-5]（0.6×10-6～0.7×10-6 g/L）為抑菌劑，采用稀釋涂布法對土壤中的放線菌進行分離，然后置于28 ℃生化培養箱內倒置培養7～10 d，觀察放線菌的生長情況，根據菌落形態選取不同菌株，經純化后將單菌落轉接到高氏一號斜面培養基上編號培養14 d，然后于4 ℃保藏。

1.2.2菌株的初篩采用固體平板發酵培養的方法篩選[7]，即高氏一號培養放線菌7～10 d，將長好的放線菌打孔后反向放置于接種了農業治病真菌的平板中央，在25 ℃條件真菌培養箱中培養2～3 d后觀察測量抑菌圈。試驗過程均設3個重復。

1.2.3菌株的復篩采用濾紙片法[8]測定發酵濾液對植物病原菌的拮抗性。將初篩所得放線菌菌株在28 ℃、150 r/min 條件下液體振蕩培養7 d，將培養液4 000 r/min無菌離心10 min。將無菌濾紙片在離心所得上清液中浸泡 3 min 后置于接種農業致病真菌的PDA平板中央，于25 ℃條件下恒溫培養72 h后，再分別測量抑菌圈直徑。對照為浸無菌水的濾紙片。試驗設3個重復。最終確定抑菌活性明顯的菌株作為目的生防菌。

1.2.4放線菌鑒定通過觀察菌株CTF619-D的菌絲形態、孢子和孢子絲形狀、菌株在不同培養基上的培養特征以及一系列的生理生化特征，按照《鏈霉菌鑒定手冊》[9]對菌株CTF619-D進行初步的分類鑒定。

（1）形態特征。將菌株CTF619-D接種于高氏一號培養基上，在28 ℃下插片培養7～10 d后，分別用光學顯微鏡和電子掃描顯微鏡觀察插片上的基內菌絲、氣生菌絲、孢子絲和孢子的形態特征。

（2）培養特征。將菌株CTF619-D分別接種在不同的培養基上（Ⅰ.高氏一號合成培養基，Ⅱ.葡萄糖天門冬素瓊脂培養基，Ⅲ.PDA培養基，Ⅳ.伊莫松培養基，Ⅴ.牛肉膏蛋白胨培養基，Ⅵ.無機鹽淀粉瓊脂培養基，Ⅶ.高氏一號培養基，Ⅷ.馬鈴薯浸汁培養基，Ⅸ.蔗糖察氏培養基），置于28 ℃生化培養箱中培養，分別在10、20 d觀察培養基內菌絲、氣生菌絲、可溶性色素的顏色及表觀特征。

（3）生理生化指標。參照《鏈霉菌鑒定手冊》對菌株CTF619-D進行以下生理生化試驗：Ⅰ.明膠液化試驗，Ⅱ.淀粉水解試驗，Ⅲ.牛奶凝固與胨化，Ⅳ.硝酸鹽還原反應，Ⅴ.纖維素分解試驗，Ⅵ.產生硫化氫試驗，Ⅶ.產生黑色素試驗，Ⅷ.碳源的利用試驗等，檢測觀察菌株的生理生化指標[10]。

（4）16S rDNA測序及序列分析。在80 ℃下挑取用試管培養的CTF619-D新鮮菌體變性15 min，然后離心取上清液作為模板進行PCR擴增。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。取5 μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳，使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒切膠回收目的片段后，經大連寶生物（工程）有限公司完成DNA測序。用微波法[11]提取總DNA，以Seq Forward、Seq Internal、Seq Reverse為引物進行DNA測序，采用正向引物（27 f）5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′、反向引物（1 492 f）5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′將測得的基因序列復制到Blast程序中，與GenBank中核苷酸數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行對比分析，然后選取與試驗菌株序列相似度較高的菌株，利用DNAstar軟件對目標序列繪制系統發育樹，并對所構建的進化樹進行評估[12]，確定所測菌株的分類地位[13]。

2結果與分析

2.1活性菌株的分離和篩選

對20多株放線菌進行抑菌活性的初篩，大多數菌株抑菌活性很低，但CTF619-D對多數植物病原真菌有抑制效果，其中對黃瓜炭疽病菌和番茄炭疽病菌抑制效果很好（圖1、表1）。

2.2放線菌CTF619-D菌株的鑒定

2.2.1形態特征觀察 拮抗放線菌CTF619-D菌株在高氏一號培養基上28 ℃培養7～10 d后，可形成基內菌絲和氣生菌絲，在電子顯微鏡下觀察，放線菌CTF619-D基內菌絲不斷裂，無橫隔，成分枝狀；氣生菌絲發達，成熟后發育成孢子

2.2.2培養特征觀察菌株在不同的培養基上表現出不同的生長情況，并形成豐富的氣生菌絲和基內菌絲（表2）。

2.2.3生理生化特性菌株革蘭氏染色呈陽性，生長溫度范圍為5～40 ℃，最適溫度為28 ℃，生長pH值范圍為5～10，最適pH值為7.0。菌株CTF619-D可使明膠緩慢液化；能夠水解淀粉；使牛奶不凝固，但胨化；不能水解纖維素；硝酸鹽還原反應為陽性；能夠產生H2S、黑色素；能利用甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、D-木糖、果糖、肌醇、乳糖、鼠李糖等（表3）。

3結論

本試驗主要通過稀釋分離的方法從采集的土壤中得到若干放線菌，進而用20種農業致病真菌對其進行初篩和復篩，選出抑菌效果好的放線菌CTF619-D，對其進行發酵培養，并采用抑制菌絲生長速率法對抗菌物質進行抗菌活性測定，結果表明，CTF619-D對番茄炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌有較好的抑菌效果，其中對番茄炭疽病菌的抑菌圈直徑最大能達到2.8 cm。通過形態學鑒定、培養特征觀察、生理生化指標測定、16s rDAN序列的測定及系統進化樹分析，結果表明，CTF619-D菌株與淡紫灰鏈霉菌FSHJ9聚為一支，序列同源性達到100%，但其形態特征、培養特征和生理生化特性方面又存在著明顯的區別，因此可初步確定CTF619-D為淡紫灰鏈霉菌的一個新變種，命名為淡紫灰鏈霉菌黃河變種。另外

該菌株是否能看作是農用抗生素的一個新來源，還需要后續試驗來進一步驗證。

據報道，在植物病害生物防治中，拮抗微生物主要是鏈霉菌屬及其相關類群[14]，淡紫灰鏈霉菌是一類重要的抗生素產生菌，它產生的醫用抗生素（如薰衣草菌素、鏈絲菌素）和農用抗生素（如中生菌素等）都已有廣泛的用途[15]。目前，國內關于拮抗淡紫灰鏈霉菌鑒定的諸多研究中，除產生中生菌素的淡紫灰鏈霉菌海南變種外，未見有其他淡紫灰鏈霉菌變種的報道。因此CTF619-D是一株有價值的具生物活性的生防菌株，該菌株有效活性成分分離鑒定及其抑菌機理均有待進一步研究，以期開發在瓜果蔬菜病害防治領域中具有應用前景的抗菌物質。

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