地黃耐百草枯的有效成分分析

楊德亮　徐鳳　劉秀　張闖　吳明根

摘要：地黃對百草枯除草劑具有較強的耐性，為了解地黃耐百草枯的有效成分，分別以300 g/hm2或600 g/hm2的百草枯處理地黃。結果表明，處理后10 d，藥害等級分別為0級和2級，且藥害癥狀恢復較快；當百草枯與地黃提取液或毛蕊花糖苷標準樣品混合處理大豆幼苗時，百草枯對大豆葉片的藥害癥狀減輕，說明地黃提取物或毛蕊花糖苷具有解除百草枯氧化毒性的功能。地黃葉片和塊根中黃酮含量分別為2.29%和1.59%，毛蕊花糖苷的含量分別是7015、0.475 mg/g，葉片中的含量多于塊根。

關鍵詞：百草枯；地黃；黃酮；毛蕊花糖苷；耐藥性

中圖分類號：S451.2文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0100-02

收稿日期：2013-05-20

基金項目：國家自然科學基金（編號：31160370）。

作者簡介：楊德亮（1987—），男，吉林長春，碩士研究生，從事農田雜草防除研究。E-mail：dely1987@foxmail.com。

通信作者：吳明根（1958—），男，吉林龍井人，博士，教授，從事農田雜草防除研究。Tel：（0433）02435566；E-mail：5minggen@163.com。百草枯（Paraquat）屬于高氧化活性的滅生性除草劑，在土壤中易失去活性，無殘留[1]。地黃（Rehmannia glutinosa L.）[2]為玄參科地黃屬植物，是傳統的中藥植物資源。前期研究結果表明，地黃生長期具有耐除草劑百草枯特性[3-4]，地黃乙醇提取物具有清除DPPH自由基能力的抗氧化特性[5]，地黃等玄參科植物提取物——梓醇、毛蕊花糖苷、多糖等具有清除DPPH自由基的能力[6-7]。因此，本試驗進行地黃提取物以及毛蕊花糖苷對減輕百草枯除草劑的藥害特征分析，揭示地黃耐百草枯除草劑的機理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物地黃（Rehmannia glutinosa L.）品種為河北省引種品種（代號85-5）。大豆品種為黑農48。

1.1.2供試除草劑與試劑 百草枯：20% 克無蹤由先正達南通作物保護有限公司提供。蕓香苷標準品：由廣州威佳科技有限公司提供，毛蕊花糖苷標準品由上海源葉生物科技有限公司提供；甲酸和甲醇為色譜純；亞硝酸鈉、95%乙醇、硝酸鋁、99.5%乙醚、氫氧化鈉均為分析純。

1.1.3供試儀器液相色譜儀（Agilent 1100型），電子分析天平（CPA324S型），軌道震蕩培養箱（SI500型），分光光度計（UV-1700 PharmaSpec型），減壓旋轉蒸發儀（EYEL4型）和索氏提取器等。

1.2試驗方法

1.2.1地黃耐百草枯特性觀察地黃出苗后20 d進行百草枯田間莖葉處理，劑量分別為300、600 g/hm2，以噴清水處理為對照。各處理重復3次，小區面積0.01 hm2。施藥后10、20、40 d分別調查藥害癥狀。

1.2.2地黃提取物和毛蕊花糖苷標準品的百草枯解毒性測定將20%百草枯1 mL與不同量的地黃塊根提取液混合，加水定容至 100 mL，利用微型噴霧器均勻噴灑到長出2個復葉的大豆葉片上，施藥后20 d分別調查藥害癥狀觀察。

將不同濃度的百草枯分別與不同濃度的毛蕊花糖苷標樣混合配比后均勻涂抹在大豆葉片上，處理后20 d肉眼觀察癥狀。

1.2.3地黃體內總黃酮含量的測定總黃酮類標準曲線制作：稱取蕓香苷5.0 mg，用60%乙醇定容至50 mL，得濃度為 0.1 mg/mL 的標準溶液。準確吸取標準溶液0、1.0、2.0、30、4.0、5.0 mL，分別加入30%乙醇至5 mL。再加0.3 mL 5% NaNO2 溶液，搖勻放置6 min；再加0.3 mL 10% Al（NO3）3 溶液，搖勻放置6 min；再加1 mol/L NaOH溶液4 mL，再加 0.4 mL 水，搖勻，放置10～15 min；于510 nm波長處測定吸光度，繪制蕓香苷濃度（C）與吸光度（D）的標準曲線。

地黃提取、待測液的配制：將新鮮地黃葉片（7月9日取樣）和塊根（10月18日取樣）在60 ℃烘干箱中烘干72 h。葉片采用索氏提取法，以無水99.5%乙醚為脫脂劑，于43 ℃水浴中脫脂除去脂類和脂溶性色素，再將其置于烘干箱中 130 ℃ 烘干備用。稱取干燥地黃塊根和葉片粉末樣品各1份0.5 g，于50 mL錐形瓶中，分別加70%乙醇，以50 ℃水浴浸提4 h，過濾，得測定樣液。準確吸取樣液2.5 mL，稀釋到 50 mL，再吸取5 mL于試管中，加0.3 mL 5% NaNO2 溶液，搖勻，放置 6 min，再加0.3 mL 10% Al（NO3）3 溶液，搖勻，放置 6 min，再加1 mol/L NaOH溶液4 mL，再加0.4 mL蒸餾水，搖勻，放置10～15 min，同時作空白試劑為對照，于510 nm波長處測定吸光度，通過查標準曲線，計算出地黃葉片和塊根的總黃酮含量。

樣品中的黃酮量=CV1V21V3V4m×1/10（1）

式中：V1為第1次定容的體積（mL）；V2為第2次定容的體積（mL）；V3為從第1次定容后的溶液中取出來進行第2次定容的體積（mL）；V4為從第二次定容后的溶液中取出來進行測定的體積（mL）；m為樣品質量（g）。

1.2.4地黃體內毛蕊花糖苷含量的測定洗脫程序：Zorbax C18色譜柱（4.6 m×250 mm，5 μm），流速1 mL/min，檢測波長為332 nm，以0.5 %甲酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫。

標準樣品溶液的制備：稱取毛蕊花糖苷標樣3.0 mg，加入3 mL流動相，制成1 mg/mL的溶液，將其稀釋至0.25 mg/mL。

地黃待測樣品溶液的制備：稱取地黃干塊根粉末0.8 g和搗碎葉片3 g，分別加甲醇50 mL，稱質量，震蕩24 h，靜止后再稱質量，加甲醇補足，搖勻，過濾，精密量取濾液20 mL，減壓回收溶劑近干，用流動相溶解殘渣，轉移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即為待測液。

樣品含量測定：液相色譜檢測后按公式（2）計算樣品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A樣品×C對照品×j對照品1A對照品×m樣品1V×j樣品（2）

式中：A為峰面積；j為進樣量；C為對照品純度；m為樣品質量；V為樣品定容體積。

2結果與分析

2.1百草枯處理對地黃、大豆的藥害

2.2地黃體內總黃酮含量

在510 nm波長處測定蕓香苷標準樣品不同濃度（C）與吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5線性關系（圖1），其線性范圍為0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通過樣品中的黃酮量計算公式（1）計算出地黃塊根、葉的黃酮含量分別為159%和2.29%，葉片中的黃酮含量高于塊根（表5）。

3結論

毛蕊花糖苷是一種很強的抗氧化劑，在動物細胞中已經證實它具有防止脂質過氧化的能力[9]。高劑量百草枯對大豆葉片產生藥害，而地黃提取液和毛蕊花糖苷標準品對大豆葉片無影響，當地黃提取液或毛蕊花糖苷標準品與百草枯混合處理大豆葉片時，百草枯對大豆葉片無藥害，說明地黃耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黃塊根和葉的黃酮含量分別為1.59%和2.29%，且葉片中的黃酮含量高于塊根；地黃葉片的毛蕊花糖苷含量分別為7.015 mg/g和0.475 mg/g，說明地黃葉片中毛蕊花糖苷含量高于塊根中的含量。

參考文獻：

[1]樸仁哲，趙洪顏，金玉姬. 地黃田特用除草劑百草枯的初步研究[J]. 農藥，2008，47（4）：288-289，291.

[3]Jae C C，Sang Y M. Physiological response of Rehmannia glutinosa to paraquat and its tolerance mechanisms[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1997，59：51-63.

[4]武寶開，Mitchell E D，Johnson B L，等. 野生種花生葉片內超氧化物歧化酶及其抗百草枯特性[J]. 植物生理學報，1990，16（2）：147-152.

[5]趙洪顏，林昊，金玉姬，等. 地黃葉片提取物抗氧化活性及其薄層色譜的初步研究[J]. 安徽農業科學，2009，37（4）：1458-1459，1462.

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地黃待測樣品溶液的制備：稱取地黃干塊根粉末0.8 g和搗碎葉片3 g，分別加甲醇50 mL，稱質量，震蕩24 h，靜止后再稱質量，加甲醇補足，搖勻，過濾，精密量取濾液20 mL，減壓回收溶劑近干，用流動相溶解殘渣，轉移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即為待測液。

樣品含量測定：液相色譜檢測后按公式（2）計算樣品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A樣品×C對照品×j對照品1A對照品×m樣品1V×j樣品（2）

式中：A為峰面積；j為進樣量；C為對照品純度；m為樣品質量；V為樣品定容體積。

2結果與分析

2.1百草枯處理對地黃、大豆的藥害

2.2地黃體內總黃酮含量

在510 nm波長處測定蕓香苷標準樣品不同濃度（C）與吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5線性關系（圖1），其線性范圍為0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通過樣品中的黃酮量計算公式（1）計算出地黃塊根、葉的黃酮含量分別為159%和2.29%，葉片中的黃酮含量高于塊根（表5）。

3結論

毛蕊花糖苷是一種很強的抗氧化劑，在動物細胞中已經證實它具有防止脂質過氧化的能力[9]。高劑量百草枯對大豆葉片產生藥害，而地黃提取液和毛蕊花糖苷標準品對大豆葉片無影響，當地黃提取液或毛蕊花糖苷標準品與百草枯混合處理大豆葉片時，百草枯對大豆葉片無藥害，說明地黃耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黃塊根和葉的黃酮含量分別為1.59%和2.29%，且葉片中的黃酮含量高于塊根；地黃葉片的毛蕊花糖苷含量分別為7.015 mg/g和0.475 mg/g，說明地黃葉片中毛蕊花糖苷含量高于塊根中的含量。

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地黃待測樣品溶液的制備：稱取地黃干塊根粉末0.8 g和搗碎葉片3 g，分別加甲醇50 mL，稱質量，震蕩24 h，靜止后再稱質量，加甲醇補足，搖勻，過濾，精密量取濾液20 mL，減壓回收溶劑近干，用流動相溶解殘渣，轉移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即為待測液。

樣品含量測定：液相色譜檢測后按公式（2）計算樣品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A樣品×C對照品×j對照品1A對照品×m樣品1V×j樣品（2）

式中：A為峰面積；j為進樣量；C為對照品純度；m為樣品質量；V為樣品定容體積。

2結果與分析

2.1百草枯處理對地黃、大豆的藥害

2.2地黃體內總黃酮含量

在510 nm波長處測定蕓香苷標準樣品不同濃度（C）與吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5線性關系（圖1），其線性范圍為0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通過樣品中的黃酮量計算公式（1）計算出地黃塊根、葉的黃酮含量分別為159%和2.29%，葉片中的黃酮含量高于塊根（表5）。

3結論

毛蕊花糖苷是一種很強的抗氧化劑，在動物細胞中已經證實它具有防止脂質過氧化的能力[9]。高劑量百草枯對大豆葉片產生藥害，而地黃提取液和毛蕊花糖苷標準品對大豆葉片無影響，當地黃提取液或毛蕊花糖苷標準品與百草枯混合處理大豆葉片時，百草枯對大豆葉片無藥害，說明地黃耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黃塊根和葉的黃酮含量分別為1.59%和2.29%，且葉片中的黃酮含量高于塊根；地黃葉片的毛蕊花糖苷含量分別為7.015 mg/g和0.475 mg/g，說明地黃葉片中毛蕊花糖苷含量高于塊根中的含量。

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