地黃耐百草枯的有效成分分析

楊德亮　徐鳳　劉秀　張闖　吳明根

摘要：地黃對百草枯除草劑具有較強(qiáng)的耐性，為了解地黃耐百草枯的有效成分，分別以300 g/hm2或600 g/hm2的百草枯處理地黃。結(jié)果表明，處理后10 d，藥害等級分別為0級和2級，且藥害癥狀恢復(fù)較快；當(dāng)百草枯與地黃提取液或毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品混合處理大豆幼苗時，百草枯對大豆葉片的藥害癥狀減輕，說明地黃提取物或毛蕊花糖苷具有解除百草枯氧化毒性的功能。地黃葉片和塊根中黃酮含量分別為2.29%和1.59%，毛蕊花糖苷的含量分別是7015、0.475 mg/g，葉片中的含量多于塊根。

關(guān)鍵詞：百草枯；地黃；黃酮；毛蕊花糖苷；耐藥性

中圖分類號：S451.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0100-02

收稿日期：2013-05-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31160370）。

作者簡介：楊德亮（1987—），男，吉林長春，碩士研究生，從事農(nóng)田雜草防除研究。E-mail：dely1987@foxmail.com。

通信作者：吳明根（1958—），男，吉林龍井人，博士，教授，從事農(nóng)田雜草防除研究。Tel：（0433）02435566；E-mail：5minggen@163.com。百草枯（Paraquat）屬于高氧化活性的滅生性除草劑，在土壤中易失去活性，無殘留[1]。地黃（Rehmannia glutinosa L.）[2]為玄參科地黃屬植物，是傳統(tǒng)的中藥植物資源。前期研究結(jié)果表明，地黃生長期具有耐除草劑百草枯特性[3-4]，地黃乙醇提取物具有清除DPPH自由基能力的抗氧化特性[5]，地黃等玄參科植物提取物——梓醇、毛蕊花糖苷、多糖等具有清除DPPH自由基的能力[6-7]。因此，本試驗(yàn)進(jìn)行地黃提取物以及毛蕊花糖苷對減輕百草枯除草劑的藥害特征分析，揭示地黃耐百草枯除草劑的機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物地黃（Rehmannia glutinosa L.）品種為河北省引種品種（代號85-5）。大豆品種為黑農(nóng)48。

1.1.2供試除草劑與試劑 百草枯：20% 克無蹤由先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司提供。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品：由廣州威佳科技有限公司提供，毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品由上海源葉生物科技有限公司提供；甲酸和甲醇為色譜純；亞硝酸鈉、95%乙醇、硝酸鋁、99.5%乙醚、氫氧化鈉均為分析純。

1.1.3供試儀器液相色譜儀（Agilent 1100型），電子分析天平（CPA324S型），軌道震蕩培養(yǎng)箱（SI500型），分光光度計(jì)（UV-1700 PharmaSpec型），減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYEL4型）和索氏提取器等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1地黃耐百草枯特性觀察地黃出苗后20 d進(jìn)行百草枯田間莖葉處理，劑量分別為300、600 g/hm2，以噴清水處理為對照。各處理重復(fù)3次，小區(qū)面積0.01 hm2。施藥后10、20、40 d分別調(diào)查藥害癥狀。

1.2.2地黃提取物和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的百草枯解毒性測定將20%百草枯1 mL與不同量的地黃塊根提取液混合，加水定容至 100 mL，利用微型噴霧器均勻噴灑到長出2個復(fù)葉的大豆葉片上，施藥后20 d分別調(diào)查藥害癥狀觀察。

將不同濃度的百草枯分別與不同濃度的毛蕊花糖苷標(biāo)樣混合配比后均勻涂抹在大豆葉片上，處理后20 d肉眼觀察癥狀。

1.2.3地黃體內(nèi)總黃酮含量的測定總黃酮類標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取蕓香苷5.0 mg，用60%乙醇定容至50 mL，得濃度為 0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、30、4.0、5.0 mL，分別加入30%乙醇至5 mL。再加0.3 mL 5% NaNO2 溶液，搖勻放置6 min；再加0.3 mL 10% Al（NO3）3 溶液，搖勻放置6 min；再加1 mol/L NaOH溶液4 mL，再加 0.4 mL 水，搖勻，放置10～15 min；于510 nm波長處測定吸光度，繪制蕓香苷濃度（C）與吸光度（D）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

地黃提取、待測液的配制：將新鮮地黃葉片（7月9日取樣）和塊根（10月18日取樣）在60 ℃烘干箱中烘干72 h。葉片采用索氏提取法，以無水99.5%乙醚為脫脂劑，于43 ℃水浴中脫脂除去脂類和脂溶性色素，再將其置于烘干箱中 130 ℃ 烘干備用。稱取干燥地黃塊根和葉片粉末樣品各1份0.5 g，于50 mL錐形瓶中，分別加70%乙醇，以50 ℃水浴浸提4 h，過濾，得測定樣液。準(zhǔn)確吸取樣液2.5 mL，稀釋到 50 mL，再吸取5 mL于試管中，加0.3 mL 5% NaNO2 溶液，搖勻，放置 6 min，再加0.3 mL 10% Al（NO3）3 溶液，搖勻，放置 6 min，再加1 mol/L NaOH溶液4 mL，再加0.4 mL蒸餾水，搖勻，放置10～15 min，同時作空白試劑為對照，于510 nm波長處測定吸光度，通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出地黃葉片和塊根的總黃酮含量。

樣品中的黃酮量=CV1V21V3V4m×1/10（1）

式中：V1為第1次定容的體積（mL）；V2為第2次定容的體積（mL）；V3為從第1次定容后的溶液中取出來進(jìn)行第2次定容的體積（mL）；V4為從第二次定容后的溶液中取出來進(jìn)行測定的體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4地黃體內(nèi)毛蕊花糖苷含量的測定洗脫程序：Zorbax C18色譜柱（4.6 m×250 mm，5 μm），流速1 mL/min，檢測波長為332 nm，以0.5 %甲酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。

標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備：稱取毛蕊花糖苷標(biāo)樣3.0 mg，加入3 mL流動相，制成1 mg/mL的溶液，將其稀釋至0.25 mg/mL。

地黃待測樣品溶液的制備：稱取地黃干塊根粉末0.8 g和搗碎葉片3 g，分別加甲醇50 mL，稱質(zhì)量，震蕩24 h，靜止后再稱質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足，搖勻，過濾，精密量取濾液20 mL，減壓回收溶劑近干，用流動相溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即為待測液。

樣品含量測定：液相色譜檢測后按公式（2）計(jì)算樣品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A樣品×C對照品×j對照品1A對照品×m樣品1V×j樣品（2）

式中：A為峰面積；j為進(jìn)樣量；C為對照品純度；m為樣品質(zhì)量；V為樣品定容體積。

2結(jié)果與分析

2.1百草枯處理對地黃、大豆的藥害

2.2地黃體內(nèi)總黃酮含量

在510 nm波長處測定蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)樣品不同濃度（C）與吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5線性關(guān)系（圖1），其線性范圍為0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通過樣品中的黃酮量計(jì)算公式（1）計(jì)算出地黃塊根、葉的黃酮含量分別為159%和2.29%，葉片中的黃酮含量高于塊根（表5）。

3結(jié)論

毛蕊花糖苷是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，在動物細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)它具有防止脂質(zhì)過氧化的能力[9]。高劑量百草枯對大豆葉片產(chǎn)生藥害，而地黃提取液和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品對大豆葉片無影響，當(dāng)?shù)攸S提取液或毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品與百草枯混合處理大豆葉片時，百草枯對大豆葉片無藥害，說明地黃耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黃塊根和葉的黃酮含量分別為1.59%和2.29%，且葉片中的黃酮含量高于塊根；地黃葉片的毛蕊花糖苷含量分別為7.015 mg/g和0.475 mg/g，說明地黃葉片中毛蕊花糖苷含量高于塊根中的含量。

參考文獻(xiàn)：

[1]樸仁哲，趙洪顏，金玉姬. 地黃田特用除草劑百草枯的初步研究[J]. 農(nóng)藥，2008，47（4）：288-289，291.

[3]Jae C C，Sang Y M. Physiological response of Rehmannia glutinosa to paraquat and its tolerance mechanisms[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1997，59：51-63.

[4]武寶開，Mitchell E D，Johnson B L，等. 野生種花生葉片內(nèi)超氧化物歧化酶及其抗百草枯特性[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1990，16（2）：147-152.

[5]趙洪顏，林昊，金玉姬，等. 地黃葉片提取物抗氧化活性及其薄層色譜的初步研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（4）：1458-1459，1462.

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[9]Liu M J，Li J X，Guo H Z，et al. The effects of verbascoside on plasma lipid peroxidation level and erythrocyte membrane fluidity during immobilization in rabbits：a time course study[J]. Life Sciences，2003，73（7）：883-892.戈林泉，王芳，吳進(jìn)才. 2種選擇性農(nóng)藥的使用對稻縱卷葉螟產(chǎn)卵及生理生化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：102-105.

地黃待測樣品溶液的制備：稱取地黃干塊根粉末0.8 g和搗碎葉片3 g，分別加甲醇50 mL，稱質(zhì)量，震蕩24 h，靜止后再稱質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足，搖勻，過濾，精密量取濾液20 mL，減壓回收溶劑近干，用流動相溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即為待測液。

樣品含量測定：液相色譜檢測后按公式（2）計(jì)算樣品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A樣品×C對照品×j對照品1A對照品×m樣品1V×j樣品（2）

式中：A為峰面積；j為進(jìn)樣量；C為對照品純度；m為樣品質(zhì)量；V為樣品定容體積。

2結(jié)果與分析

2.1百草枯處理對地黃、大豆的藥害

2.2地黃體內(nèi)總黃酮含量

在510 nm波長處測定蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)樣品不同濃度（C）與吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5線性關(guān)系（圖1），其線性范圍為0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通過樣品中的黃酮量計(jì)算公式（1）計(jì)算出地黃塊根、葉的黃酮含量分別為159%和2.29%，葉片中的黃酮含量高于塊根（表5）。

3結(jié)論

毛蕊花糖苷是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，在動物細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)它具有防止脂質(zhì)過氧化的能力[9]。高劑量百草枯對大豆葉片產(chǎn)生藥害，而地黃提取液和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品對大豆葉片無影響，當(dāng)?shù)攸S提取液或毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品與百草枯混合處理大豆葉片時，百草枯對大豆葉片無藥害，說明地黃耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黃塊根和葉的黃酮含量分別為1.59%和2.29%，且葉片中的黃酮含量高于塊根；地黃葉片的毛蕊花糖苷含量分別為7.015 mg/g和0.475 mg/g，說明地黃葉片中毛蕊花糖苷含量高于塊根中的含量。

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地黃待測樣品溶液的制備：稱取地黃干塊根粉末0.8 g和搗碎葉片3 g，分別加甲醇50 mL，稱質(zhì)量，震蕩24 h，靜止后再稱質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足，搖勻，過濾，精密量取濾液20 mL，減壓回收溶劑近干，用流動相溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即為待測液。

樣品含量測定：液相色譜檢測后按公式（2）計(jì)算樣品中毛蕊花糖苷的含量。

毛蕊花糖苷含量=A樣品×C對照品×j對照品1A對照品×m樣品1V×j樣品（2）

式中：A為峰面積；j為進(jìn)樣量；C為對照品純度；m為樣品質(zhì)量；V為樣品定容體積。

2結(jié)果與分析

2.1百草枯處理對地黃、大豆的藥害

2.2地黃體內(nèi)總黃酮含量

在510 nm波長處測定蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)樣品不同濃度（C）與吸光度（D）值，得到D=1.020 6C-0.015 5線性關(guān)系（圖1），其線性范圍為0～0.05 mg/mL，r2=0.991 8。通過樣品中的黃酮量計(jì)算公式（1）計(jì)算出地黃塊根、葉的黃酮含量分別為159%和2.29%，葉片中的黃酮含量高于塊根（表5）。

3結(jié)論

毛蕊花糖苷是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，在動物細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)它具有防止脂質(zhì)過氧化的能力[9]。高劑量百草枯對大豆葉片產(chǎn)生藥害，而地黃提取液和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品對大豆葉片無影響，當(dāng)?shù)攸S提取液或毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品與百草枯混合處理大豆葉片時，百草枯對大豆葉片無藥害，說明地黃耐百草枯氧化的有效成分之一是毛蕊花糖苷。

地黃塊根和葉的黃酮含量分別為1.59%和2.29%，且葉片中的黃酮含量高于塊根；地黃葉片的毛蕊花糖苷含量分別為7.015 mg/g和0.475 mg/g，說明地黃葉片中毛蕊花糖苷含量高于塊根中的含量。

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[8]魏福香. 除草劑藥害試驗(yàn)方法[J]. 雜草科學(xué)，1992（3）：18-21.

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