冷凍保存對豬精子DNA完整性及形態結構的影響

羊建平　武彩紅　趙旭庭　周春寶　姚靜　張斌　鄭筱峰

摘要：采集姜曲海豬精液，對其進行超低溫冷凍保存，解凍后分別通過顯微鏡、掃描電鏡和吖啶橙染色觀察其形態、超微結構和DNA完整性，探討冷凍保存對豬精子DNA完整性及形態結構的影響，同時探討海藻糖和乳糖對冷凍精子的保護作用。結果表明，冷凍后精子形態正常率（海藻糖組和乳糖組分別為74.7%、67.6%）及DNA完整率（海藻糖組和乳糖組分別為66.4%和63.2%）均顯著低于新鮮精子（95.5%和94.7%），且冷凍組間也存在顯著差異（P<0.05）；冷凍造成精子結構不同程度的損傷，主要表現為精子頭頸部發生部分或全部斷裂，頸部腫脹，頂體結構損傷。

關鍵詞：豬精子；冷凍保存；DNA；形態結構

中圖分類號：S828.3+4文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0151-02

收稿日期：2013-05-20

項目基金：江蘇省自然科學基金（編號：BK2008589）；江蘇省“青藍工程”項目[編號：蘇教師2010（27）號]；江蘇省無錫市農業產學研合作項目。

作者簡介：羊建平（1965—），男，江蘇泰興人，碩士，副教授，主要從事動物醫學教學及科研工作。E-mail：jstzyip@yahoo.com.cn。精子的長期保存在畜牧業、低溫生物學種質資源保存及動物基因研究等方面具有重要的意義；但冷凍保存豬精液應用于人工授精的比例尚不足1%，仍存在冷凍-解凍后活力差、受胎率低、產仔數少等諸多問題[1-2]。許多學者致力于豬冷凍精液的研究，但關于精子冷凍后DNA損傷及超微結構研究較為缺乏。因此，本試驗探索冷凍保存對豬精子DNA完整性及超微結構的影響。

1材料與方法

1.1精液采集

4只成年、健康、性欲旺盛的姜曲海種公豬由國家級姜曲海種豬場提供。利用手握法采集精液，立即置于保溫桶中，1 h 內帶回實驗室。將精液用專用濾紙過濾至37 ℃預熱燒杯中，然后按照1 ∶1.5與稀釋液（德國米尼圖MII稀釋劑）進行稀釋。

1.2稀釋液和冷凍液的配置

1.2.1冷凍基礎液的配置分別稱取葡萄糖1.1 g，Tris 2.42 g，檸檬酸鈉1.48 g，青霉素0.06 g和鏈霉素0.1 g，溶解于雙蒸水中，定容至100 mL。

1.2.2冷凍液的配置冷凍I液：海藻糖組（冷凍1組），在稀釋液的基礎上添加375 mmol/L 海藻糖、0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）、0.05 %維生素C和20%卵黃；乳糖組（冷凍2組），在稀釋液的基礎上添加375 mmol/L 乳糖、0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）、0.05 %維生素C和20%卵黃。冷凍Ⅱ液：在冷凍I液的基礎上添加甘油，使其終濃度為3%。

1.2.3吖啶橙染色液的配置吖啶橙溶液：吖啶橙0.1 g溶解于100 mL蒸餾水中；枸櫞酸溶液：枸櫞酸1.91 g溶解于100 mL蒸餾水中；磷酸氫二鈉溶液：Na2HPO4·12H2O 10.74 g于100 mL蒸餾水中。臨用時，分別取吖啶橙染色液10 mL、枸櫞酸溶液40 mL、磷酸氫二鈉溶液7.5 mL混合，即為吖啶橙染色液。

1.3精液冷凍-解凍方法

將1 ∶1.5稀釋后的精液置于17 ℃過夜，17 ℃離心（800 g，12 min），棄上清，然后加入冷凍I液于4 ℃平衡 1.5 h；再加入等體積4 ℃預冷的冷凍Ⅱ液，使精液最終稀釋比為 1 ∶2，然后再于4 ℃平衡、分裝于0.25 mL細管中，不超過 45 min，距液氮面3 cm熏蒸10 min，然后投入液氮保存 7 d。

解凍時，將細管從液氮中迅速取出，直接投入37 ℃水浴中并迅速搖晃。將解凍后的精液收集于10 mL試管內，然后用9倍體積的PBS液清洗精子。

1.4精子正常形態率的檢測

于相差顯微鏡下直接觀察活精子的正常形態率，至少計數200個精子。將巨型精子，短小精子，雙頭或雙尾精子，頂體膨脹或脫落精子，精子頭部殘缺或與尾部分離、尾部變曲精子等，均視為畸形精子。

1.5精子DNA完整性的檢測

將精液用PBS洗3次，棄上清，調整精子濃度為2×104個/mL，涂片，自然晾干，無水乙醇-冰醋酸（3 ∶1）固定 5 min，然后置入盛有新鮮配制的吖啶橙染液的染色缸中染色10 min。蒸餾水清洗，晾干后，石蠟油封片，于熒光顯微鏡觀察、計數[3]。DNA 雙鏈完整的精子呈現綠色，表明有受精能力；DNA 雙鏈損傷的精子呈現紅色或黃色，表明無受精能力，計數300個精子。

1.6掃描電鏡樣本制備

新鮮和試驗1組冷凍-解凍精子樣本于2.5%戊二醛中4 ℃固定6 h，再經PBS清洗3次，1次30 min；隨后，將精子包埋于4%瓊脂中，再于1%鋨酸（OsO4）中固定1.5 h，然后再經PBS清洗3次[4]；之后，乙醇逐級脫水，乙酸異戊脂置換；臨界點干燥儀干燥，IB-5離子濺射儀噴金，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察、拍照。

1.7數據處理

所獲試驗數據采用SPSS 軟件進行差異顯著性分析。

2結果

2. 1冷凍對豬精子超微結構的影響

在掃描電鏡下，豬新鮮精子（圖1-A、B）頭、頸、尾結構完整；頭部由細胞核和頂體組成；頂體結構完整，邊界清晰，邊緣整齊，局部無隆起，表面無空洞；尾部完整。冷凍-解凍后，豬精子頭部和頸部發生全部或部分斷裂（圖1-C、D、E），頸部腫脹（圖1-E）；頂體結構損傷（圖1-E）或消失僅見核結構（圖1-F）。

2.2冷凍對豬精子形態正常率及DNA完整性的影響

由表1可見，冷凍1組、冷凍2組及新鮮對照組間精子形態正常率和DNA完整率均存在顯著差異（P<0.05），且冷凍1組和冷凍2組精子的形態正常率和DNA完整率又顯著低于新鮮精子（P<0.05）。冷凍1組的形態正常率及DNA完整率又顯著高于冷凍2組（P<0.05）。

表1冷凍對豬精子形態正常率及DNA完整性的影響

處理1形態正常率

（%）1DNA完整率

（%）海藻糖組（冷凍1組）174.7±1.75b166.4±1.68b乳糖組（冷凍2組）167.6±1.52c163.2±1.84c新鮮精液（對照組）195.5±1.55a194.7±1.70a注：同一列后不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。

3討論

精子的受精能力與精子的形態結構密切相關[5]。頂體位于精子頭部前端，其內含有多種與受精相關的酶。精卵融合前精子必須發生頂體反應，頂體酶才能發揮作用[6]。可見，完整的頂體結構是正常頂體反應的基礎。精子細胞作為遺傳物質的主要傳遞者，其DNA完整程度直接關系到精子質量及其后代的生長發育[7]。本研究發現，冷凍后豬精子形態結構及DNA完整率均顯著低于新鮮精子。在掃描電鏡下，冷凍精子頭頸結合處斷裂、頸部腫脹、頂體結構損傷或消失。許多研究結果表明，冷凍損傷是低溫冷凍任何哺乳動物精子所難以避免的。冷凍損傷主要與細胞內外冰晶形成所致的機械性損傷及滲透壓改變所致的化學性損傷[8-9]、細胞膜功能紊亂[10]和Na+-K+-ATP酶障礙[11]等因素有關。

本研究也發現，添加海藻糖組的冷凍精子形態完整率和DNA完整性均比添加乳糖組的高，表明海藻糖對豬精子冷凍保存具有較好的保護作用，這與張樹山等的研究結果[12]一致。海藻糖是一種非常穩定的非還原性雙糖，在冷凍過程中，可以在細胞膜外產生一種玻璃狀的防護層，從而提高細胞對高滲透的耐受性，具有穩定細胞膜和蛋白質結構的特性[13]。冷凍過程中，精子核蛋白對DNA雙鏈的保護作用被削弱，造成精子線粒體與核基因組的DNA損傷，DNA雙鏈變性為單鏈DNA，該損傷可能是造成胚胎發育不良和流產的主要原因。李剛琴等的研究結果表明，精子DNA易受活性氧的攻擊，造成氧化損傷，進而引起形態結構發生改變而發生不育[7]。但有資料表明，人精子冷凍保存并不影響完整的精子核DNA鏈，僅可能加重冷凍前已損傷精子核DNA鏈的損傷程度[14-15]，這可能和人精子冷凍保存方法成熟有關，但也說明豬精子冷凍保存方法仍需繼續探索。

參考文獻：

[1]張樹山，李青旺，胡建宏，等. 紅景天多糖對豬精子冷凍保護效果的研究[J].農業生物技術學報，2010，18（3）：519-525.

[2]Flores E，Cifuentes D，Fernández-Novell J M，et al. Freeze-thawing induces alterations in the protamine-1/DNA overall structure in boar sperm[J]. Theriogenology，2008，69（9）：1083-1094.

[3]孫靜波，姜宏，何瑞冰.精子DNA完整性與精液參數的相關性研究[J]. 中國男科學雜志，2010，24（4）：26-29.

[4]彭影，劉雨生，童先宏，等. 掃描電鏡下畸形精子增多癥患者的精子形態觀察[J]. 中國男科學雜志，2007，21（2）：37-42，45.

[5]Pesch S，Bergmann M. Structure of mammalian spermatozoa in respect to viability，fertility and cryopreservation[J]. Micron，2006，37（7）：597-612.

[6]OFlaherty C，Rodriguez P，Srivastava S. L-arginine promotes capacitation and acrosome reaction in cryopreserved bovine spermatozoa[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2004，1674（2）：215-221.

[7]李剛琴，何映. 精子線粒體DNA損傷與男性不育[J]. 中國優生與遺傳雜志，2010，18（4）：4-5.

[8]Agca Y，Mullen S，Liu J，et al. Osmotic tolerance and membrane permeability characteristics of rhesus monkey（Macaca mulatta）spermatozoa[J]. Cryobiology，2005，51（1）：1-14.

[9]Agca Y，Critser J K. Cryopreservation of spermatozoa in assisted reproduction[J]. Seminars in Reproductive Medicine，2002，20（1）：15-23.

[10]Pegg D E. The history and principles of cryopreservation[J]. Seminars in Reproductive Medicine，2002，20（1）：5-13.

[11]Martin G，Sabido O，Durand P，et al. Cryopreservation induces an apoptosis-like mechanism in bull sperm[J]. Biology of Reproduction，2004，71（1）：28-37.

[12]張樹山，李青旺，李剛，等. 海藻糖、蔗糖和乳糖對豬精液冷凍保護效果的影響[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2006，34（6）：41-45，51.

[13]García de Castro A，Tunnacliffe A. Intracellular trehalose improves osmotolerance but not desiccation tolerance in mammalian cells[J]. FEBS Letters，2000，487（2）：199-202.

[14]宋博，鄭履康，鄧麗霞，等. 冰凍對精子DNA的影響[J]. 中華男科學，2002，8（4）：253-254.

[15]肖清明，徐紅，何宗明，等. 精液冷凍對不育患者精子核DNA鏈完整性影響的研究[J]. 山東醫藥，2005，45（19）：10-11.邵春榮，黃廣明，李健. 微生態制劑克洛生對斷奶仔豬生產性能的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：153-154.